(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210524620.X (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 河南省农业科 学院烟草研究所 地址 461000 河南省许昌市魏都区青梅路 与永昌大道交叉口 (72)发明人 邱睿　李小杰　何晓冰　白静科　 赵均　陈玉国　李成军　李淑君　 张盈盈　姚晨虓　郑文明　邢国珍　 王遂法　宋瑞芳　李彩虹　房文祎　 (74)专利代理 机构 郑州意创知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 41138 专利代理师 张江森　张燕红 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01)A01N 63/22(2020.01) A01P 3/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C12R 1/085(2006.01) (54)发明名称 一株蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀 菌根腐病和促 生长中的应用 (57)摘要 本发明涉及微生物应用领域， 具体涉及一株 蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀菌根腐病 和促生长中的应用， 包括蜡样芽胞杆Y X53的筛选 和分析测定方法， 蜡样芽胞杆Y X53在防治烟草镰 刀菌根腐病和促生长中的应用； 本发 明公开一种 对烟草镰刀菌根腐病原具有明显拮抗效果的蜡 样芽孢杆菌 （Bacillus  cereus） YX53， 并对其抑 菌机理和促生特性进行了初步分析。 该菌株对烟 草主要根茎类病害抑菌谱广， 主要通过抑制孢子 萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀 菌产生较强的抑菌效果， 且可促进烟株生长发 育， 为后续研究和田间生物防治的应用奠定基 础。 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 114806960 A 2022.07.29 CN 114806960 A 1.一株蜡样芽胞杆YX53， 其特征在于： 所述的蜡样芽胞杆YX53的筛选和分析测定方法 的操作包括以下步骤： 步骤一： 提供实验用的供 试材料， 供试材料包括采集 健康烟株根际土壤样本； 步骤二： 提供实验用的供试菌株， 供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌 B‑9‑1、 茄病镰刀菌A ‑4‑9， 烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种、 烟草根黑腐病病原菌 烟草根串珠霉， 烟草白绢病菌， 烟草立枯病病原菌立枯丝核菌， 鸢尾丝囊霉菌及烟草溃疡病 病原菌葡萄座腔球菌： 步骤三： 提供实验用的供 试培养基， 供试培养基包括 LB液体培 养基与PDA培养基； 步骤四： 进行微 生物分离， 采用稀释涂布 平板法， 从土壤中分离纯化细菌 菌株； 步骤五： 筛选拮抗菌株， 利用平板对峙培养法， 以烟草尖孢镰刀 菌和茄病镰刀 菌为靶标 病原菌， 筛 选拮抗细菌， 并计算抑菌率； 步骤六： 拮抗菌株的抑菌谱测定， 采用平板对峙培养法， 进行生防菌株对多种常见烟草 病原真菌抑菌试验， 从而筛 选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的拮抗菌株； 步骤七： 拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定， 采用培养皿滤纸保湿法， 测量种子 萌发及计算增长率； 步骤八： 拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定， 制备拮抗菌发酵滤液， 采用平板打孔法测试 生防菌发酵 滤液的抑菌作用， 测定拮抗菌发酵 滤液对病原菌孢子萌发的影响作用； 步骤九： 拮抗菌挥发性 化合物的抑菌活性测定， 计算相对抑菌率； 步骤十： 拮抗细菌 的鉴定， 结果显示菌株YX53 的16S rDNA基因序列与其比对的芽孢杆 菌属同源相似度在99%， 与蜡样 芽胞杆菌EH11等的序列相似性达到100%， 且位于同一进化分 支； 步骤十一： 拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定， 挑出大小一 致的健壮烟苗， 将烟苗根部浸泡于在拮抗细菌悬浮液中， 进 行拮抗菌悬浮液灌根， 设置对照 组， 根据中华人民共和国国家标准中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况， 计算 发病情况及生防菌防效， 根据中华人民共和国烟草行业标准中的农艺性状测量方法测定生 防菌对农艺性状的影响， 测量指标包括烟株的有效叶片数、 最大叶长、 最大叶宽、 地上鲜重 和根系鲜重 。 2.根据权利要求1所述的蜡样芽胞杆YX53在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114806960 A 2一株蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长 中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及微生物应用领域， 具体涉及一株蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀 菌根腐病和促 生长中的应用。 背景技术 [0002]烟草(Nicotiana  tabacum L.)属于茄科烟草属， 是一种商业化的叶用经济作物 (曾文艺等， 2022)。 中国是烟草种植面积和产量最 大的国家( 等， 2020)， 病害一直 是 影响烟草生产的重要因素之一， 据不完全统计， 我国每年因病害造成的烟叶产量损失约 10％‑30％。 近年来随着气候条件、 土壤微生态和 耕作制度等变化， 烟草镰刀菌根腐病已成 为危害烟草的重要根茎类真菌病害(李小杰等， 2020)， 引起烟草镰刀菌根腐病的主要病原 是尖孢镰刀菌(Fusarium  oxysporum)和茄病镰刀菌(Fusarium  solani)(邱睿等， 2 018)。 目 前防治作物镰刀菌根腐病的主要策略是利用抗病品种和化学防治， 但抗病种植资源有限、 选育抗病品种周期 长， 化学防治主要 是通过化学杀菌剂来杀死或抑制病原菌生长达到防治 效果， 烟草镰刀菌根腐病在苗床和大田期均可发生(于庆涛等， 2018)， 因此需要多次施用才 能达到一定的防治效果， 但长期使用化学药剂会造成环境污染、 农药残留、 病原菌产生抗药 性等问题(邱睿等， 2016)， 长期大量使用化学农药还可加 速病菌群体遗传结构生理分化和 变异(程海洋等， 2021)。 近年来， 植物病害的防治已由化学防治逐渐向生物防治转变， 其中 以拮抗微生物或其代谢产物为核心的生物防治技术因其针对性强、 可选择范围广、 对人畜 安全无害、 对环境无污染、 不易引起病原菌耐药性等特点而备受学者们关注(韩长志， 2015)， 生防微生物的应用成为防治植物病虫害的重要手段， 利用拮抗菌防治烟草病害已有 相关报道(赵誉强等， 2022)。 针对烟草镰刀菌根腐病生防菌研究较多的是木霉菌 (Trichoderma spp.)。 [0003]2021年从豫中烟区烟草根际土壤中分离筛选出对烟草尖孢镰刀菌具有拮抗作用 的棘孢木霉(Trichoderma  asperellum)Tr ‑0111； 2015年通过平板稀释法从洛阳地区烟田 土壤中获得对尖孢镰刀菌具有较好拮抗效果的哈茨木霉(Tricho derma harzianum)、 棘孢 木霉、 深绿木霉(Trichoderma  atroviride)和毛簇木霉(Trichoderma  viride)； 2020年通 过平板对峙筛选出对烟草镰刀菌根腐病病原菌具拮抗作用的两种木霉菌， 粗壮木霉 (Trichoderma  strigosum)和钩 状木霉(Trichoderma  hamatum)； 2 019年从烟草根际土壤中 分离筛选出对烟草尖孢镰刀菌具有较强抑制作用的放线菌金黄垂 直链霉菌(Strept omyces  aureoverticillatus)； 2020年通过平板对峙试验结果表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus   velezensis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)对木香尖孢镰刀菌的抑菌率均达到 66％以上； 2019年研究发现生防细菌JK2015对菌尖孢镰刀菌茄子专化型(Fusarium   oxysporum  f.sp.melongenae， Fom)和尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(Fusarium   oxysporum  f.sp.cubense  race 4， Foc4)抑菌效果显著， 抑菌率达到52％以上； 由此可见， 目前关于烟草镰刀菌根腐病生防细菌相关研究相对较少。 为筛选出对烟草镰刀菌根腐病病说　明　书 1/10 页 3 CN 114806960 A 3