(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210531520.X (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 湖北天惠生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区光 谷大道74 号 (72)发明人 刘泽伟　王咏　韩威　童文华　 刘海琳　 (74)专利代理 机构 武汉江楚智汇知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42228 专利代理师 黄丽娟 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养 制备工艺 (57)摘要 本发明公开了一种不易受杂菌感染的枯草 芽孢杆菌培养制备工艺， 具体涉及枯草芽孢杆菌 技术领域， 包括以下步骤： 种子活化培养基制备， 完成种子活化培养基制备后， 对种子活化培养基 进行消毒； 种子活化， 将菌种接种至种子活化培 养基中进行 活化处理， 活化后的菌种储存在冰箱 中备用。 本发明对种子活化培养、 种子培养和发 酵培养过程中， 种子活化培养基制备后采用高压 灭菌锅进行灭菌， 种植培养基制备完成后采用 100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～ 20min， 发酵培养基制备后采用湿热灭菌法进行 灭菌操作， 整个培养制备过程采用全面的灭菌操 作， 制备过程中全程对杂菌进行处理杀菌操作， 且本发明整体的制备过程明显改善菌体的生长 培养情况。 权利要求书1页 说明书8页 CN 115181686 A 2022.10.14 CN 115181686 A 1.一种不 易受杂菌感染的枯 草芽孢杆菌 培养制备工艺， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 种子活化培 养基制备， 完成种子活化培 养基制备后， 对种子活化培 养基进行消毒； S2、 种子活化， 将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理， 活化后的菌种储存在冰 箱中备用； S3、 种子培养， 种子培养基制备， 种子培养基配方碳源材料、 氮源材料、 无机盐材料和 水， 将碳源材料、 氮源材料、 无机 盐材料放入烧杯中混合均匀后， 加入 水进行搅拌， 得到种子 培养基， 将种子培养基装入三角瓶中， 并将活化后的菌种接种到种子培养基中， 将三角瓶放 入温控摇床中， 在温度37℃、 转速120r/min条件下培养24h， 最后将得到的产物作为种子液 备用； S4、 种子发酵培养， 发酵培养基制备， 发酵培养基配方为葡萄糖9.4 g/L， 酵母膏6.9g/L， 氯化钠3g/L， 磷酸二氢钾0.2g/L， 硫 酸镁MgSO0.2g/L， 硫酸锰 10.2mg/L， 碳酸钙0.2g/L， 按比 例称取葡萄糖， 酵母膏， 氯化钠， 磷酸二氢钾， 硫酸镁， 硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中， 将其 混合均匀后， 向三角瓶中加入水， 搅拌均匀即得到发酵培养基， 将S3中得到的种子液以2％ 的接种量接种 于发酵培养基中， 装液量为100/250mL， 同时在振荡器中130r/min， 37℃下震 荡培养48h。 2.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺， 其特征 在于： 所述S 3中种子培养基的碳源 材料为牛肉膏或葡萄糖， 氮源材料为蛋白胨， 无机盐材料 为氯化钠， 牛肉膏或葡萄糖的用量为0.3％ ‑0.5％， 蛋白胨的用量为0.8％， 氯化钠的用量为 0.4％， 水的用量 为1000mL， 种子 培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0 ‑7.2。 3.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺， 其特征 在于： 所述S1中种子活化培养基的配方为， 牛肉膏0.4％， 蛋白胨0.8％， 氯化钠0.4％， 水 1000mL， 琼脂粉1％， 将上述配方量的牛 肉膏、 蛋白胨和氯化钠放入烧杯中， 并加入少量水， 搅拌成糊状， 然后将糊状溶液均与倒入少 于培养基总体积的沸水中， 加热 的同时对其进行 搅拌， 待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液， 将可溶性淀粉溶液倒入 烧杯中， 称取配方量的琼脂放入 可溶性淀粉溶液中， 在加热溶化， 随后加入适量水至培养基 总体积， 即得到种子活化培 养基。 4.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺， 其特征 在于： 所述S2中的种子活化过程具体为， 将S1 中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中， 装 入量为三角瓶容量的1/2， 并使用密封膜密封， 将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作， 灭菌 过程保持125℃， 时间为20min， 随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养 基中， 在37℃的恒温培 养箱中活化培 养48h， 最后将活化后的菌种储 存在冰箱中备用。 5.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺， 其特征 在于： 所述S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作， 所述S3 中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作， 灭菌过程为将种子培养基 100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～ 20min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181686 A 2一种不易受杂菌感 染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺 技术领域 [0001]本发明涉及枯草芽孢杆菌技术领域， 更具体地说， 本发明涉及一种不易受杂菌感 染的枯草芽孢杆菌 培养制备工艺。 背景技术 [0002]芽孢是产芽孢类细菌在生长繁殖过程中产生的一种抗逆休眠体， 一般会在培养基 中的必需营养即将耗尽时产生， 它并不是芽孢杆菌类细第一生中必须经历的一个阶段， 更 不是细菌繁殖的一种形式。 在遇到一些特殊的环 境时， 就会在体内形成含水量比较低、 抗逆 性较强的芽孢。 芽孢因其自身 具备的多个特点在科研及生产生活等多方面 都有应用， 例如， 由于芽孢对恶劣环境有很强的耐受力和抵抗力， 在这样的环境里生命力持久很难被杀死， 所以芽孢可以协助细菌度过外界环境对菌体生存不利的时期， 使其得以存活下来。 在实验 室里， 芽孢也是保存菌种的适宣材料， 通过保存菌种的芽孢某些菌种的保存时间可达十年 之久。 另外， 食品生产方面， 在乳制品中抗生素残留检测所用的试剂盒 中起到主要作用的就 是芽孢。 [0003]枯草芽孢杆菌是一种好氧型菌， 其菌体代谢活力强， 在条件收变时能产芽孢 自我 保护的微生物， 其代谢产 物也有很高的酶活性， 而且属于清洁型生物菌种， 不污染大白然环 境， 也对人对动物无害， 广泛应用于饲料以及水治理行业21。 芽孢体和营养体菌体相比更容 易保存， 且的发率高， 而在规代化机器制备芽孢菌剂过程中， 可以较好的保存菌剂中菌体的 活性， 而菌剂 中的芽孢数量更是影响菌剂实用性的重要闪素。 芽孢的产生是在菌体培养环 境变化较大， 菌体存活受到抑制时产生的自我保护体。 日前， 生产过程中的主要问题是芽孢 的产生率较低。 [0004]且枯草芽孢杆菌制备发育过程若是对杂菌的处置不够理想， 可能存在明显的杂菌 干扰， 甚至出现杂菌影响枯草芽孢杆菌的发育过程， 导致最终得到的枯草芽孢杆菌纯度不 够， 同时发育数量受到较大影响， 且整体的制备流程不够完善， 因此需要一种不易受杂菌感 染的枯草芽孢杆菌 培养制备工艺 来解决上述问题。 发明内容 [0005]为了克服现有技术的上述缺陷， 本发明提供了一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆 菌培养制备工艺， 本发明所要解决的技术问题是： 草芽孢杆菌制备发育过程若是对杂菌的 处置不够理想， 可能存在明显的杂菌干扰， 甚至出现杂菌影响枯草芽孢杆菌的发育过程， 导 致最终得到的枯草芽孢杆菌纯度不够， 同时发育数量受到较大影响， 且整体的制备流程不 够完善的问题。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆 菌培养制备工艺， 包括以下步骤： [0007]S1、 种子活化培养基制备， 完成种子活化培养基制备后， 对种子活化培养基进行消 毒；说　明　书 1/8 页 3 CN 115181686 A 3