(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210534664.0 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 沈阳建筑大学 地址 110168 辽宁省沈阳市 浑南区浑南中 路25号 (72)发明人 唐玉兰　何亚婷　董畅　马悦　 邵星焱　查曼丽　李继伟　 (74)专利代理 机构 沈阳优普达知识产权代理事 务所(特殊普通 合伙) 21234 专利代理师 任凯 (51)Int.Cl. C02F 3/34(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 11/02(2006.01) C12R 1/07(2006.01)C12R 1/125(2006.01) C02F 101/30(2006.01) C02F 101/38(2006.01) C02F 101/16(2006.01) (54)发明名称 一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物 制剂及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明属于环 境微生物 技术领域， 具体涉及 一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂 及其制备方法与应用。 本发明的技术方案如下： 一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂， 包括固定化微生物体和生物促生剂， 所述固定化 微生物体包括微生物和改性生物炭(固定化载 体)， 所述微生物包括东洋芽孢杆菌、 阿氏芽孢杆 菌和枯草芽孢杆菌， 所述改性生物炭为由 5.5mol/L  HNO3改性的废弃核桃壳； 所述生物促 生剂包括碳源、 营养蛋白、 氨基酸和生物酶。 本发 明具有工艺流程短、 操作方法简单、 投资低、 见效 快等特点， 特别适用于农村黑臭 水体的治理。 权利要求书2页 说明书12页 序列表3页 附图7页 CN 114890555 A 2022.08.12 CN 114890555 A 1.一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂， 其特征在于， 包括固定化微生物体 和生物促生剂， 所述固定化微生物体包括微生物和改性生物炭， 所述微生物包括东洋芽孢 杆菌、 阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌， 所述改性生物炭为由5.5mol/L  HNO3改性的废弃核桃 壳； 所述生物促生剂包括 碳源、 营养蛋白、 氨基酸和生物酶。 2.根据权利要求1所述的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制 剂， 其特征在于， 所述 东洋芽孢杆菌、 阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液体积比为2： 1： 2； 所述东洋芽孢杆 菌、 阿氏芽孢杆菌和枯 草芽孢杆菌的有效活菌数独立 为(1～1.5) ×105CFU/mL。 3.根据权利要求1所述的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制 剂， 其特征在于， 所述 改性生物炭和微 生物的比例为1： 20 0， 即1g改性 生物炭吸附20 0ml菌悬液。 4.根据权利要求1所述的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制 剂， 其特征在于， 所述 生物促生剂和固定化 微生物体质量比为2： 1。 5.如权利要求1 ‑4之一所述的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1.菌株的筛 选 a.富集： 采集农村黑臭水体的黑臭底泥低温密封保存， 取1g底泥于10ml无菌水中， 充分 震荡得到底泥悬浮液； 吸取5ml底泥悬浮液于牛 肉膏蛋白胨培养基中进行富集培养24h； 吸 取5ml富集培养液于牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h(重复培养3次)； 培养条件为30℃， 120r/min； b.初筛： 吸取最后一次富集培养液， 依次稀释为1： 10、 1： 102、 1： 103、 1： 104、 1： 105稀释液， 分别吸取1： 103、 1： 104、 1： 105稀释液0.2ml涂布于分离平板， 30℃恒温培养1～2d， 挑取生长 速度快、 形态不同的菌落接种到分离 培养基进行划线纯化， 得到10株初筛 菌株； c.复筛： 将初筛得到的单菌株接种到LB培养基中活化24h， 活化条件为30℃， 120r/min； 取10ml各菌株活化培养液接入100ml黑臭水样中培养24h， 测定水样中COD和NH4+‑N浓度， 选 择3株高COD和NH4+‑N降解率的菌株作为目标菌； 步骤2.菌株的16S  rDNA测序鉴定 采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA， 利用27F/1492R引物对筛选获得的菌株 DNA进行PCR扩增； 在NCBI数据中的Blast比对系统中输入测序得到的序列信息， 查找数据库 中相似性较高的序列， 应用ME GA7.0软件进 行聚类分析并构建系统发育树； 通过菌株的系统 发育树， 鉴定 3株菌分别为 东洋芽孢杆菌、 阿氏芽孢杆菌和枯 草芽孢杆菌； 步骤3.复合菌液的制备 测定东洋芽孢杆菌、 阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生长曲线， 选择对数增长期增长 到80％左右的时间点作为最佳培养时间， 将此时间点的菌液作为种子液， 此时微生物繁殖 速度快， 代谢能力强； 按照最佳培养时间在LB培养基中培养菌株， 吸取活化培养液10ml， 5000r/min离心10min， 弃去上清液， 加入10ml灭菌0.86％NaCl摇匀， 再次离心10min弃去上 清液， 最后用10 ml灭菌0.86％NaCl洗下沉淀制成各菌株种子液； 东洋芽孢杆菌、 阿氏芽孢杆 菌和枯草芽孢杆菌的种子液按照体积比2： 1： 2复配为复合菌液， 备后续使用； 步骤4.改性 生物炭的制备 取废弃核桃壳清洗烘干， 使用破碎机破碎至1～2mm， 置于马弗炉中， 700℃下裂解2h后 利用去离子水反复清洗， 75℃烘干， 过60目筛(0.4mm)得到生物炭； 将生物炭放入5.5mol/L  权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114890555 A 2HNO3溶液中， 浸泡12h得到改性生物炭； 获得的改性生物炭用去离子水淋洗， 放置105℃烘箱 中干燥24h， 备用； 步骤5.固定化 微生物体的制备 称取1g改性生物炭， 高压灭菌冷却后加入200ml复合菌液中， 置于恒温振荡培养箱中振 荡培养24h(30℃、 150r/min)； 取出后静置， 无菌水淋洗过 滤， 得到固定化 微生物体； 步骤6.固体微 生物制剂的制备 称取2g生物促生剂与步骤5制备的1g固定化微生物体混合， 即固定化微生物体与生物 促生剂的质量比为2： 1， 获得固体微 生物制剂。 6.如权利要求5所述的制备方法制备的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制 剂的应 用， 其特征在于， 采用间歇曝气， 曝气量0.5 ‑1L/min， 每天曝气4 ‑6h； 所述固体微生物制剂的 投放量为2.5‑4.5g/L。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114890555 A 3