(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210548376.0 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 加来 （济南） 生活科技有限公司 地址 250000 山东省济南市中国 （山 东） 自 由贸易试验区济南片区经十东路 28666号济南超算中心科技园2号楼4 层406-1室 (72)发明人 刘青　周娟　李雪　 (74)专利代理 机构 济南格源知识产权代理有限 公司 373 06 专利代理师 张蕾 (51)Int.Cl. A61K 8/9789(2017.01) A61Q 19/02(2006.01) A61Q 19/10(2006.01)A61Q 19/08(2006.01) C12N 9/48(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/10(2006.01) (54)发明名称 一种具有去角质功能的苦参发酵液及发酵 方法 (57)摘要 本发明属于微生物发酵技术领域， 尤其涉及 一种具有去角质功能的苦参发酵液及发酵方法。 本发明所述发酵方法包括以下步骤： （1） 菌种活 化： 配置LB培养基， 在LB培养基上培养菌落； （2） 中草药处理： 从多种抗氧化中药中优选苦参作为 皮肤调理剂； （3） 发酵： 将 优选菌种和中草药在不 同条件下进行 发酵培养。 本发明通过对产角蛋白 酶的菌株和中草药混合发酵条件的优化研究， 获 得了角蛋白酶活力较好的发酵条件。 旨在促使菌 株发酵水平进一步提高， 降低发酵成本， 为角蛋 白类物质的开发利用提供新的科 学方法。 权利要求书2页 说明书8页 CN 114681383 A 2022.07.01 CN 114681383 A 1.一种具有 去角质功能的苦参发酵 液的发酵 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 菌种活化： 配置LB培 养基， 在LB培 养基上培 养菌落； （2） 中草药处 理： 对苦参进行处 理， 得到苦参半成品； （3） 发酵： 步骤 （1） 培养菌落中优选菌种， 将优选菌种和步骤 （2） 所得苦参半成品进行发 酵培养， 得到发酵 液； （4） 效果验证： 对步骤 （3） 所得发酵液进行效果验证， 包括： 去角质效果验证、 美白效果 验证、 抗氧化能力验证。 2.根据权利 要求1所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述LB 培养基的配制包括以下步骤： 称取以下重量份的原料： 胰蛋白胨10份、 酵母提取物5份、 氯化 钠10份， 加蒸馏水搅拌均匀， 调PH至7.0， 搅拌均匀后定容， 分装， 其中一部分作为液体培养 基， 另一部分加琼脂粉配置成固体培 养基， 用高压蒸汽灭菌锅灭菌后放在室温下 备用。 3.根据权利要求2所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述培 养菌落的具体方法为： 将保藏的菌液从冰箱中取出解冻， 放在 冰盒中备用， 用微波炉融化固 体培养基， 在 超净工作台上， 将培养基均匀倒在灭过菌的培养皿中， 加入抗生素， 待凝固后， 用接种环蘸取菌液， 在平板上进行划线， 放在37℃培 养箱中过夜培 养。 4.根据权利要求1所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 优选菌 种的具体方法为： 步骤 （1） 所述菌落培养20 ‑36小时后， 用灭过菌的牙签挑取单菌落放置在 LB液体培 养基中， 3 0‑37℃、 150‑300r摇菌4‑12小时后， 选取较浓稠的一 瓶菌液用于发酵。 5.根据权利要求4所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 所述发 酵的具体方法为： 1） 吸取权利要求4中选取的菌液， 按1 ‑3%的比例接种至另一瓶LB液体培养基中， 30 ‑37 ℃、 150‑300r摇菌4‑12小时后测OD值， 直至OD值达 到0.4‑0.6时即可作为发酵菌液； 2） 将LB培养基替换为发酵培养基， 按1 ‑5%的比例接种发酵菌液， 按5% ‑20%苦参的比例 加入水、 LB培养基或发酵培养基， 28 ‑35℃、 100 ‑200r摇菌36 ‑72小时后， 进行酶活测定， 并检 测酪氨酸酶抑制率和D PPH清除率。 6.根据权利要求1所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 所述去 角质效果验证的方法为： 以发酵 液中自提可 溶性角蛋白酶为底 物测定角蛋白酶活性。 7.根据权利要求6所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 所述以自提可溶性 角蛋白为底物测定角蛋白酶活性的方法： 取稀释好的40  μl可溶性角蛋白酶液加入40μl   0.5%可溶性角蛋白底物， 40℃水浴反应10  min后加入80 μl  0.4 mol/l TCA溶液终止反应； 对照组取稀释好的40 μl酶液加入80 μl  0.4 mol/lTCA溶液终止反应， 40℃水浴反应10  min 后加入40μl  0.5%可溶性角蛋白底物； 反应结束后， 10000r/min离心2min， 吸取上清于280   nm波长下测定吸光度； 角蛋白酶活性单位 （U） 定义为： 混合反应体系中每分钟使OD280值比 对照组每升高0.01定义 为1U。 8.根据权利要求1所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 所述美 白效果验证的方法为： 检测抑制酪氨 酸酶的能力， 酪氨酸 酶活性抑制实验的具体方法： 使用   10mL 试管设立样品管 （T） 、 样品本底 （T0） 、 酶反应管 （C） 和溶剂本底 （C0） ， 每一样品的每个 受试浓度的样品管 （T） 需设立  3 支平行管， 同时酶反应管 （C） 也需设立  3 支平行管； 在样 品管 （T） 和样品本底 （T0） 中各加入  1mL 相同浓度的样品溶液， 酶反应管 （C） 和溶剂本底权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114681383 A 2（C0） 则分别加入  1mL 磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲液； 在样品管 （T） 和酶反应管 （C） 中各加入   0.5mL 酪氨酸酶溶液， 样品本底 （T0） 与溶剂本底 （C0） 以  0.5mL磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲液 代替， 将样品和酪氨酸酶充分混匀， 置  37℃水浴槽孵育  10 分钟； 依次在各管中加入  2mL  的左旋多巴溶液， 控制每管反应时间为  5 分钟， 即刻将各管反应溶液移入比色皿中， 在   475nm 处测定吸光 值。 9.根据权利要求1所述的具有去角质功能的发酵方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 所述抗 氧化能力验证的方法为： 检测自由基清除效率， 自由基清除实验方法： 使用  10mL 试管设立 样品管 （T） 、 样品本底 （T0） 、 DPPH  管 （C） 和溶剂本底 （C0） ， 每一样品的每个受试浓度的样品 管 （T） 需设立3支平行管， 同时  DPPH 管 （C） 也需设立3支平行管； 在样品管 （T） 和样品本底 （T0） 中各加入  1mL 相同浓度的样品溶液； 在所有试管中 （T、 T0、 C、 C0） 补充溶剂， 水溶性样 品用水， 油溶性样品用95%乙醇， 补足3mL， 混匀； 在样品管 （T） 和  DPPH 管 （C） 中加入DPPH  乙 醇溶液1mL， 样品本底 （T0） 和溶剂本底 （C0） 用95%乙醇代替， 轻轻摇匀， 室温下静置5分钟； 将 各支反应溶 液移入1cm比色皿中， 在517nm处测定吸光 值。 10.一种具有去角质功能的苦参发酵液， 其特征在于， 采用权利要求1 ‑9任一所述的发 酵方法制备 得到。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114681383 A 3