ICS 65.020.20 CCS B16 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2188—2021 农杆菌介导油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）遗传转化技术规程 Technical code of practice for Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation in Leptosphaeria biglobosa 2021-05-25 发布 2021-06-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2188—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古自治区农牧业信息中心。 本文件主要起草人：宋培玲、李子钦、史志丹、贾晓清、皇甫海燕、燕孟娇、杨永青、郝丽芬、郭 晨、皇甫九茹、罗军。 I DB15/T 2188—2021 农杆菌介导油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）遗传转化技 术规程 1 范围 本文件规定了农杆菌介导油菜黑胫病菌（L. biglobosa）的遗传转化技术参数。 本文件适用于油菜黑胫病菌（L. biglobosa）的遗传转化。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 油菜黑胫病 phoma stem canker 由小球腔菌属弱致病性病原菌（Leptosphaeria biglobosa）引起的系统性侵染病害，主要危害油 菜茎上部，染病茎秆，病斑早期呈灰色，有黑色边界，茎秆干枯时病斑呈灰白色，有时肉眼可见小黑点， 即无性生殖世代( Phoma lingam) 子实体－分生孢子器。 3.2 农杆菌介导遗传转化 agrobacterium tumefaciens-mediated transformation 农杆菌介导遗传转化（ATMT）是一种依据农杆菌能够侵染植物的特点将外源基因导入植物基因组中 使目的基因表达的方法。 4 仪器和用具 4.1 仪器 电子天平、超净工作台、生物显微镜、荧光显微镜、离心机、摇床、纯水仪、生化培养箱、冰箱、 高压灭菌锅、液氮罐、凝胶成像系统、PCR仪。 4.2 用具 烧杯、、三角瓶、量筒、酒精灯、镊子、血球计数板、接种针、载玻片、盖玻片、移液器、吸头、 离心管、培养皿、纱布、漏斗。 5 试剂和培养基 1 DB15/T 2188—2021 5.1 试剂 乙酰丁香酮（AS）、2-吗啉乙磺酸（MES）、潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、 头孢噻肟钠（Cef）、葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨、琼脂粉、NaCl、K2HPO4 、KH2PO4 、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、 CaCl2·H2O、FeSO4·7H2O、DNA提取试剂盒、琼脂糖、Taq酶、PCR引物、DL2000 DNA Marker。 5.2 培养基类型 马铃薯培养基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培养基（LB）、共培养培养基（CM）、诱导培养基（IM）、 筛选培养基（SM）。 6 遗传转化方法 6.1 用于筛选阳性转化子的潮霉素浓度 用孔径为5 mm的打孔器打取黑胫病菌菌饼，接种于含有潮霉素质量浓度梯度为 0μg/mL、25μg/mL、 50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL 的PDA平板上，于25 ℃下培养7 d～12 d，筛选阳性转 化子的潮霉素浓度。 采用菌饼接种法筛选出能够完全抑制黑胫病菌生长的潮霉素浓度为50μg/mL。 6.2 农杆菌菌液制备 将含目标质粒的农杆菌（如pCHs-GFP）菌株在含（25 mg/mL）的卡那霉素和利福平的LB培养基上活 化，3 d 后挑取单菌落接种于含有上述 2 种抗生素的LB液体培养基中，28 ℃、200 rpm震荡培养。待 农杆菌菌液浓度 OD600值为0.6时，转入IM液体培养基中用于遗传转化。 6.3 分生孢子悬浮液制备 PDA平板活化黑胫病菌，待产孢后，在平板上加2 ml～3 mL无菌水，静置10 min，无菌载玻片轻刮 平板表面，2层灭菌纱布（经纬：21×21/30×28）过滤，血球计数板计算滤液中分生孢子数，无菌水调 制悬浮液（106个/mL），用于遗传转化。 6.4 黑胫病菌遗传转化 将上述准备好的孢子悬浮液与农杆菌菌液1：1等体积充分混合，取200 μL混合液均匀涂布在铺有 玻璃滤纸（0.6 μm～0.8 μm）的IM固体平板（含200 μmol/mL AS）上， 25 ℃共培养，4 d后将玻璃 滤纸揭下，反铺到含有头孢噻肟（100 mg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的SM培养基上，25 ℃培养10 d， 获得阳性转化子。 7 阳性转化子的鉴定 7.1 阳性转化子的稳定性鉴定 随机挑选数个阳性转化子，转接到PDA平板上，连续继代五代后，再重新转接到潮霉素浓度为50 μ g/mL的PDA平板上，确定阳性转化子的遗传稳定性。 7.2 阳性转化子的 PCR 鉴定 2 DB15/T 2188—2021 将上述稳定转化的阳性转化子和野生型菌株接种于PDA培养基上，25 ℃下培养14 d，收集菌丝，用 真菌DNA提取试剂盒提取DNA。以野生型菌株DNA为阴性对照，质粒为阳性对照，采用潮霉素抗性基因特 异性引物（hyg）进行PCR扩增，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。 hyg 抗性基因引物序列“5’- GATGTAGGAGGGCGTGGATA -3’，5’- CTCTGATAGAGTTGGTCAAG -3’” hyg 抗性基因引物反应条件：94 ℃预变性5min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s， 35 个循环；72 ℃延伸10 min。 PCR 反应体系(25μL)：基因组DNA 10ng，hyg 抗性基因上下游引物（0.2μM）各 0.5μL，2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。 凝胶电泳检测扩增出与特异hyg基因（712 bp）大小一致的片段，确定为阳性转化子。 7.3 阳性转化子的绿色荧光鉴定 转化质粒如带有gfp标记，可用绿色荧光进行鉴定。挑取稳定遗传且PCR反应呈阳性的转化子菌丝， 使用荧光显微镜在激发波（480 nm）下观察，呈绿色。 3