(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210620366.3 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 武汉滨会生物科技股份有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新大道666号武汉国家生物产 业基地项目B、 C、 D区研发楼B1栋2楼 B272-4室 (72)发明人 刘滨磊　蔡林康　 (74)专利代理 机构 武汉派富知识产权代理事务 所(普通合伙) 42305 专利代理师 刘艳丽 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/27(2006.01)C12N 5/10(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种双启动子质粒及其构建方法和应用 (57)摘要 本申请公开了一种双启动子质粒及其构建 方法和应用。 该质粒包括： 真核CMV启动子、 核糖 体结合位点、 T7  RNA聚合酶基因、 T7启动子、 多聚 腺嘌呤核苷酸序列、 牛生长激素多腺苷酸化信号 序列以及目的基因。 该质粒载体进入肿瘤细胞 后， 首先由CMV启动子启动T7  RNA聚合酶基因转 录， 翻译产生T7  RNA聚合酶， 所述T7  RNA聚合酶 识别质粒上的T7启动子， 转录目的基因翻译成蛋 白质。 质粒载体通过与目标基因精确结合， 并载 入表达系统， 获得更高表达量的目标蛋白。 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图2页 CN 115141846 A 2022.10.04 CN 115141846 A 1.一种质粒， 其中， 所述质粒包括： CMV启动子； 所述的C MV启动子序列如SEQ  ID NO： 1所示； 核糖体结合位点； 所述核糖 体结合位点的序列如SEQ  ID NO： 2所示； T7 RNA聚合酶基因； 所述T7  RNA聚合酶基因的序列如SEQ  ID NO： 3所示； T7启动子； 所述T7启动子的序列如SEQ  ID NO： 4所示； 多聚腺嘌呤核苷酸序列； 所述多聚腺嘌呤核苷酸序列为多个腺嘌呤A连在一起组成的 RNA序列； 牛生长激素多腺苷酸化信号序列； 所述牛生长激素多腺苷酸化信号序列如SEQ  ID NO： 5所示； 以及 目的基因。 2.权利要求1所述的质粒， 其中， T7  RNA聚合酶基因序列 位于真核CMV启动 子下游， 牛生 长激素多腺苷 酸化信号序列位于T 7 RNA聚合酶基因下游， T 7启动子位于牛生长激素多腺苷 酸化信号序列下游， 核糖体结合位点位于T7启动子下游， 目的基因位于核糖体结合位点下 游。 3.权利要求1或2任一项质粒的构建方法， 其包括以下步骤： 合成目的基因； 构建含有目的基因的第一重组真核表达质粒； 将CMV启动子、 核糖体结合位点、 T7  RNA聚合酶基因、 多聚腺嘌呤核苷酸序列及牛生长 激素多腺苷酸 化信号序列重组至第一重组真核表达质粒， 获得第二重组真核表达质粒； 对所述第二重组真核表达质粒进行筛 选， 验证， 即获得 所述质粒。 4.权利要求1或2任一项质粒在肿瘤药物中的应用。 5.权利要求1或2任一项质粒在制备mRNA药物的应用。 6.一种药物， 其药物的有效成份包含权利要求1或2任一项质粒及用于药物组合的辅 料。 7.根据权利要求 4所述的应用， 其中， 所述质粒包 含的目的基因为m GM‑CSF基因。 8.权利要求1或2任一项质粒在肿瘤 细胞的应用。 9.权利要求6所述药物在肿瘤 细胞的应用。 10.一种重组细胞， 其包 含权利要求1或2任一项质粒。 11.一种基因工程菌， 其包 含权利要求10所述重组细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141846 A 2一种双启动子质粒 及其构建 方法和应用 技术领域 [0001]本申请涉及质粒构建技术领域， 尤其涉及一种双启动子质粒、 构建方法及其应用， 更具体的是， 通过 所构建的双启动子质粒瘤内表达细胞因子抑制肿瘤生长 。 背景技术 [0002]载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。 主要包括已有载体多克隆位点 （MCS） 的改造和已有 载体启动子、 增强子、 筛选标记 等功能元件的改造。 是为把DNA分子运送 到受体细胞中去， 必须寻找一种能进入细胞、 在 装载了外来的DNA片段后仍能照 样复制的运 载体。 理想的运载体是质粒(plasmid)， 在基因工程中， 常用人工构建的质粒作为载体， 载体 构建即是构建含外源DNA的质粒。 [0003]现有技术中， 利用基因工程制备重组免疫蛋白时， 通过应用质粒中CMV  promoter （巨细胞病毒启动子） 等强启动子的在真核表达系统 （如肿瘤细胞） 里表达获得相关免疫蛋 白， 这种方法具有表达量较低、 获得的重组蛋白含量少、 成本较高等问题。 [0004]因此， 亟需构建一种质粒载体， 该质粒载体通过与目标基因精确结合， 并载入表达 系统， 获得 更高表达量的目标蛋。 发明内容 [0005]针对以上技术问题， 本申请构思在于， 提供一种连续双启动子质粒， 优化基因的表 达结构， 即构建区别于现有技术的重组质粒结构， 使其在表达系统中能够更高量地表达目 标蛋白。 [0006]结合以上构思， 本申请提供了一种具备双启动子 的全新结构的质粒载体， 所述质 粒载体进入肿瘤细胞后， 首先由巨细胞病毒 （下简称 “CMV”） 启动子启动T7  RNA聚合酶基因 转录， 翻译产生的T7  RNA聚合酶， 所述T7  RNA聚合酶识别质粒上的T7启动子， 转录目的基因 （GOI)翻译成蛋白质， 由于， 利用T7  RNA聚合酶对T7启动子转录具有一个放大的作用， 因此， 所述质粒在进入肿瘤 细胞后可以产生更多量的目标蛋白。 [0007]第一方面， 本申请实施例公开了一种质粒， 所述质粒包括： CMV启动子； 所述的C MV启动子序列如SEQ  ID NO： 1所示； 核糖体结合位点(IRES)； 所述 IRES的序列如SEQ  ID NO： 2所示； T7 RNA聚合酶基因； 所述T7  RNA聚合酶基因的序列如SEQ  ID NO： 3所示； T7启动子； 所述T7启动子的序列如SEQ  ID NO： 4所示； 多聚腺嘌呤核苷酸(pA)序列； 所述pA序列为多个腺嘌呤A连在一起组成的RNA序 列； 牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)序列； 所述BGHpA序列如SEQ  ID NO： 5所示； 以 及 目的基因 （G OI)。 [0008]进一步地， 在构建的质粒中， T7  RNA聚合酶基因序列位于真核CMV启动子下游，说　明　书 1/6 页 3 CN 115141846 A 3