ICS 65.020.30 B 443 45 5 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 CCS DBB45/T 2312—2021 水牛牛体细 细胞核核移植 植技术 术操作作规程 程 The teechnical protocol for thee somatic cell nu uclear t ransfer in buffaalo 2021 - 04 - 25 发布 发 广西壮 壮族自治区 区市场监督 督管理局 0 - 31 实施 实 2021 - 05 发 布 目 次 — DB45/T 2312 2021 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 药品试剂、耗材、设备和实验室 ....................................................... 2 5.1 药品试剂 ....................................................................... 2 5.2 耗材 ........................................................................... 2 5.3 设备 ........................................................................... 2 5.4 实验室 ......................................................................... 2 6 卵母细胞和供体细胞准备 ............................................................. 2 6.1 工作液配制 ..................................................................... 2 6.2 卵母细胞的收集 ................................................................. 2 6.4 卵母细胞体外成熟培养 ........................................................... 3 6.5 卵母细胞成熟的判定 ............................................................. 3 6.6 供体细胞的培养 ................................................................. 3 7 胚胎生产 ........................................................................... 3 8 胚胎分级 ........................................................................... 4 8.1 A 级 ........................................................................... 4 8.2 B 级 ........................................................................... 4 8.3 C 级 ........................................................................... 4 8.4 D 级............................................................................ 4 附录 A（规范性） 工作液的配制 .......................................................... 5 I 前 言 — DB45/T 2312 2021 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。 本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西壮族自治区水牛研究所。 本文件主要起草人：杨春艳、尚江华、郑海英、黄加祥、罗华、李玲玉、唐丽萍。 II — DB45/T 2312 2021 水牛体细胞核移植技术操作规程 1 范围 本文件规定了水牛体细胞核移植的试剂、耗材、设备、实验室、卵母细胞受体和供体细胞准备、胚 胎生产、胚胎分级与选择等要求。 本文件适用于广西行政区域内水牛体细胞核移植胚胎的操作。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 3.1 下列术语和定义适用于本文件。 体外成熟 in-vitro maturation 从活体或离体卵巢上获取体内未成熟的卵母细胞，在适宜的条件下进行体外成熟培养，使卵母细胞 恢复减数分裂至第二次减数分裂中期(MⅡ期)并具备受精能力的过程。 3.2 体细胞核移植 somatic cell nuclear transfer 将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透即可被激活、分裂并发育成新个体， 并使得核供体的基因得到完全复制。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（bovine serum albumin） COCs：卵丘－卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes） 6-DMAP：6－二甲氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine） DMEM：伯克改良伊格尔培养基(dulbecco modified eagle medium) DMSO：二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide） FBS：胎牛血清（fetal bovine serum） Hepes：羟乙基哌嗪乙硫磺（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid） PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphate balanced solution） Pb1：第一极体（first polar body） TCM199：组织培养基199（tissue culture medium 199） 1 — DB45/T 2312 2021 5 药品试剂、耗材、设备和实验室 5.1 药品试剂 碳酸氢钠、乙二醇、蔗糖、甘油、Hepes、肝素、TCM199、PBS、FBS、BSA、山梨醇、乙酸钙、乙酸 镁、细胞松弛素B、胰蛋白酶、透明质酸酶、离子霉素、6-DMAP。 5.2 耗材 10 mm玻璃培养皿、φ 35 mm和φ 60 mm塑料培养皿、0.22 μm滤器、细胞冻存管、胚胎吸管、5 mm玻 璃细管、透明硅胶软管、脱脂棉、纱布、封口膜、标签纸、记号笔、一次性乳胶或PE手套。 φ 5.3 设备 20×体视显微镜、CO 培养箱、-20 ℃～4 ℃冰箱或冰柜、显微操作仪、细胞融合仪、高压蒸汽灭菌 锅、超净工作台、恒温热台、超低温冰箱、电子分析天平、超声波清洗仪、电热鼓风干燥箱、超纯水仪、 液氮生物容器。 2 5.4 实验室 应具备准备室、缓冲间、无菌间和细胞保存间。其中缓冲间面积≥3 m ，配置更衣柜和紫外灯。紫 外灯强度≥1.5 W/m ，距地面≥2.5 m。核移植操作前打开紫外灯照射20 min～30 min。无菌间的无菌等 级最低应达万级，无菌间的操作区应达百级。 2 3 6 卵母细胞和供体细胞准备 6.1 工作液配制 见附录A。 6.2 卵母细胞的收集 母水牛屠宰 30 min 内收集卵巢，置于 30 ℃～37 ℃的卵巢保存液中，3 h 内送至实验室。 在无菌条件下用 35 ℃～37 ℃的卵巢保存液清洗卵巢三次，剪除周围结缔组织，用纱布吸干卵 巢表面水分，用注射器套 17 号针头抽吸卵巢表面直径 2 mm～8 mm 的卵泡，回收卵泡液及其内容物。 6.2.3 将卵泡液及内容物转入φ 60 mm 的一次性塑料培养皿中，用玻璃吸胚管或加样枪套吸头，在体视 显微镜下挑选出 COCs。 6.2.1 6.2.2 6.3 COCs 分级 6.3.1 A 级 卵母细胞胞质均匀，外周包裹三层以上致密卵丘细胞。 6.3.2 B 级 卵母细胞胞质均匀，外周包裹的卵丘细胞少于三层或部分脱落。 6.3.3 C 级 卵母细胞胞质不均匀，卵丘细胞成蛛网状扩散或全部脱落。 2 — DB45/T 2312 2021 6.3.4 D 级 卵母细胞的形状不规则，过成熟、死亡或退化。 6.4 卵母细胞体外成熟培养 选取A和B级的COCs用卵母细胞成熟培养液洗涤三次后，每100～150个转入提前预热2 h、含1 mL成熟 培养液的φ 10 mm玻璃培养皿中,并使其聚集；也可每10～15个转入50 µL覆盖石蜡油的成熟培养液微滴内。 在38.5 ℃、5％ CO 、完全相对湿度条件下静置培养22 h～24 h。 2 6.5 卵母细胞成熟的判定 COCs成熟培养后，在0.1％透明质酸酶中吹打去除外周卵丘细胞，轻轻翻转卵母细胞，如胞质均匀 且可见Pb1则判定为成熟，否则为未成熟。 6.6 供体细胞的培养 6.6.1 卵丘细胞的培养 将COCs成熟培养后，吹打并收集卵丘细胞，加入细胞培养液，培养传代至第2 代～3 代，用0.25％ 胰蛋白酶消化贴