ICS 67.050 CCS X 004 安 34 4 徽 省 地 方 标 准 DBB34/T 399 91—2021 禽蛋 蛋中替 替米考 考星残 残留的 的测定 定 高 高效液 液相色 色 谱法 法 Determ mination of o tilmicosin residuees in egg- high h perfo ormance liiquid chro omatograpphy 2021-009-03 发布 布 2021-10-03 实施 实 安徽省市场 安 场监督管理 理局 发 布 DB34/T 3991—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省兽药饲料监察所提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽安丰堂动物药业有限公司、安徽省兽药饲料监察所、利辛县双飞养殖专业合 作社、安徽省动物卫生监督所、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省农科院畜牧兽医研究所、桐城 市畜牧兽医管理中心、宣州区畜牧兽医管理局。 本文件主要起草人：张莉、刘红云、张士卿、苗文萍、章天霞、蔡一杰、郑举、吴蕾、李珲、王雨 霜、刘文文、王群、马瑞钰、丁常宏、杜腾飞。 I DB34/T 3991—2021 禽蛋中替米考星残留的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了禽蛋中替米考星残留检测的试样制备及高效液相检测方法。 本文件适用于禽蛋中替米考星的残留测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的替米考星加乙腈经涡旋匀浆后离心取上清液，正己烷液液分配去脂，固相萃取柱净化，旋 转蒸发浓缩，经色谱柱梯度洗脱分离，用紫外检测器检测，以保留时间进行定性，外标法定量。 5 试剂和材料 5.1 用水符合 GB/T 6682 中一级用水的规定。 5.2 甲醇：色谱纯。 5.3 乙腈：色谱纯。 5.4 正己烷：分析纯。 5.5 无水硫酸钠：分析纯。 5.6 磷酸：分析纯。 5.7 二丁胺：分析纯。 5.8 氢氧化钠：分析纯。 5.9 替米考星对照品：≥ 95.0％。 5.10 固相萃取柱：HLB（6 mL，200 mg）或同等柱效。 5.11 替米考星标准溶液的制备：取替米考星对照品 25.0 mg，精密称定，置 25 mL 容量瓶中，加乙 腈制成每 1 mL 中含 1 mg 的溶液，精密量取 5 mL，置 25 mL 量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀， 制成 0.2 mg/mL 的标准储备液。在试验中用磷酸溶液配置成不同浓度的标准工作液，现配现用。 1 DB34/T 3991—2021 5.12 磷酸溶液的配制：取水 900 mL，加磷酸 5.71 g，用 12.5 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 2.5 ±0.1，加水至 1000 mL。 5.13 12.5 mol/L 氢氧化钠溶液的配制：称取 50 g 氢氧化钠，溶于水，加水稀释至 100 mL。 5.14 乙腈饱和的正己烷的配制：取 100 mL 的正己烷加入 10 mL 的乙腈，充分振荡混合后，上层溶液 为乙腈饱和的正己烷。 5.15 磷酸二丁胺缓冲液：取二丁胺 16.8 mL，加磷酸溶液（1→10）70 mL，边加边搅拌，放冷后， 用磷酸调节 pH 至 2.5±0.1，加水至 100 mL。 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 7 高效液相色谱仪(配有紫外检测器或二级管阵列检测器、柱温箱)。 分析天平：感量 0.1 mg、0.01 mg。 离心机：低温冷冻离心机（≥6770G）。 超声波清洗机。 涡旋混合机。 微孔滤膜：孔径 0.45 μm 纤维素滤膜。 旋转蒸发器。 试样的制备 取待测新鲜的禽蛋去壳，充分搅拌，匀质。于 -18℃以下保存。 8 分析步骤 8.1 提取 称取 5 g±0.05 g 试样，置于 50 mL 离心管中，用 10 mL 乙腈匀浆 5 min，高速冷冻 6770G 离 心 10 min，移取上清液于 50 mL 离心管中。离心管中的残渣再用 10 mL 乙腈重复提取，合并上清液。 在合并的上清液中加入无水硫酸钠 3.0 g，乙腈饱和的正己烷 20 mL，涡旋 1 min，6770G 离心 10 min， 弃去上层正己烷。取下层溶液备用。 8.2 净化 将 HLB 固相萃取柱分别用 5 mL 甲醇和乙腈依次润洗，加入提取液 5 mL，过柱，弃去淋洗液，用 5 mL 乙腈进行洗脱，收集洗脱液于茄形瓶中，于 40℃旋转蒸发至近干，浓缩液加入 1.00 mL 磷酸溶 液溶解，过 0.45 µm 滤膜后，转移至 2 mL 进样瓶中，待测定。 8.3 测定 8.3.1 高效液相色谱条件 色谱柱：ODSC18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)。 流动相：水—磷酸二丁胺缓冲液（975：25）为流动相A，乙腈为流动相B，按表1 程序进行梯度洗 脱。 2 DB34/T 3991—2021 流速 速：1.0 mL /min。 / 柱温 温：30℃ 。 检测 测波长：280 nm。 进样 样量：10 μL。 表 表1 梯度洗脱 脱程序 时间 流动相A 流动相B （min） （％） （％） 0 82 18 30 60 40 32 82 18 40 82 18 上机测定，按 按外标法以峰 峰面积定量，标准溶液及 及试样溶液中 中替米考星峰 峰 8.3.2 取试样溶液、标准溶液上 应在仪器检测 测的线性范围 围内（见附录 录 A）。 面积均应 8.4 空白实验 星的试样，采 采用完全相同 同的测定步骤 骤进行测定（ （见附录A）。 。 在不含替米考星 8.5 表述 结果的计算与表 料中替米考星 星残留量（μg g /kg）按公式 式(1)计算： 试料 ·········································································· (1) 式中 中：  X — ——供试试样 样中替米考星 星含量，单位 位为微克/每千 千克（μg /kg）； C — ——经标准曲 曲线求得的试 试样溶液中替 替米考星浓度，单位为微克 克/每毫升（ （μg /mL）； m — ——试样质量 量，单位为克 克（g）； V — ——定容体积 积，单位为毫 毫升（mL） f — ——稀释倍数 数 注： 结果表示—— —平行测定结果 果用算术平均值 值表示，计算结 结果保留 3 位有 有效数字。 9 9.1 检测方法的灵敏度 度、准确度和 和精密度 灵敏度 方法检出限为 为 2 µg/kg，定量限为 2 0 µg/kg。 本方 9.2 准确度 方法在 20 μgg/kg～100 μg/kg μ 添加浓 浓度水平上的 的回收率为 70％～110％ 。 本方 9.3 精密度 3 DB34/T 3991—2021 本方法的批内变异系数 CV％≤10％，批间变异系数 CV％≤15％。 4 DB34/T 3991—2021 附 录 A （资料性） ） 空白样品添加替米考 考星对照品溶 溶液和空白样 样品色谱图 空白 白样品添加替 替米考星对照 照品溶液和空 空白样品色谱 谱图见图A.1、图A.2。 图 图A.1 空白样 样品中添加 1.0ng /mL 替米考星色谱 替 谱图（峰 1、峰 峰 2） 图AA.2 空白样品 品色谱图 5