ICS 11.020 CCS C62 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2265.2—2021 中蒙跨境口岸地区生物媒介鼠疫监测、检测 和防护技术规程 第二部分：检测 Technical Code of Practice for Surveillance,Detection and Self-Protection to Biological Vector of Plague in China-Mongolia Cross-border Ports Area Part2：Detection 2021-07-23 发布 2021-08-23 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2265.2—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是DB15/T 2265《中蒙跨境口岸地区生物媒介鼠疫监测、检测和防护技术规程》的第2部分。 DB15/T 2265已经发布了以下部分： ——第1部分：监测； ——第2部分：检测； ——第3部分：人员防护。 本文件由内蒙古自治区综合疾病预防控制中心、呼和浩特国际旅行卫生保健中心提出。 本文件由呼和浩特海关归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区综合疾病预防控制中心、呼和浩特国际旅行卫生保健中心、呼和浩 特海关、满洲里海关、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人：李建云、于欣欣、云托娅、高艳菲、白潇、郭文秀、韩丹、王姝懿、杨常青、 张忠兵、苏丹、杨宇。 I DB15/T 2265.2—2021 中蒙跨境口岸地区生物媒介鼠疫监测、检测和 防护技术规程 第 2 部分：检测 1 范围 本文件规定了动物鼠疫监测中宿主、媒介、血液等的检验样本采集、检验方法。 本文件适用于中蒙跨境口岸地区动物鼠疫监测中样本采集和检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 16883-1997 鼠疫自然疫源地及动物鼠疫流行判定标准 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS 233 病原微生物实验室生物安全通用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鼠疫 plague 由鼠疫耶尔森菌引起的自然疫源性疾病。主要通过染菌的鼠蚤为媒介进行传播，具有传染性强、传 播迅速、病情严重、病死率高的特点，属我国法定的检疫传染病。 4 生物安全要求 鼠疫检验材料在采集和检测过程中，实验室生物安全应符合GB 19489、WS 233、《人间传染的病原 微生物名录》（卫科教发〔2006〕15号）中规定的生物要求。 5 鼠疫检验材料采集 5.1 准备和策略 5.1.1 样本采集准备 将获得的动物分类登记，按媒介的采集方法，捡净体外寄生蚤，按下列原则采集血液、解剖取组织 样本。 1 DB15/T 2265.2—2021 5.1.2 自毙鼠类 自毙鼠类解剖后，分别观察淋巴结、肝、脾、肺、心等有无病变，取上述组织样本。 5.1.3 捕获活体鼠类 捕获活体鼠类解剖后，按下列要求进行采样： a) 正常动物：只采取肝、脾组织样本和血液样本； b) 染病萎靡动物：采集血液和淋巴结、肝、脾、肺、心组织样本。 5.2 血液样本的采集 5.2.1 股动脉放血 固定动物，消毒腹股沟处皮肤，用灭菌剪刀剪一小口，暴露股动脉，剪断血管，使血液直接流入（或 用吸管移入）螺口离心管中备用。 5.2.2 血清样本制备 收集到的血液3000 r/min离心5 min，56 ℃水浴灭活30 min，冷冻或4 ℃储存备用。 5.3 解剖取样 5.3.1 将动物腹部向上固定在解剖板上，消毒腹面，镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪一小口，然后将腹 面皮肤自下腹一直剪到下颌，再沿四肢腹面剪开一定距离，翻开皮肤分离皮下组织，充分暴露胸、腹组 织但不要剪破胸、腹腔。 5.3.2 每一步骤应将所使用的镊子和剪刀浸入 95 %酒精，在火焰上燃烧消毒，冷却后再用于下一操作。 5.4 腺体样本采集 观察淋巴结是否肿大，皮下组织是否充血或出血。如发现有肿大的淋巴结，则用无菌剪刀剪取肿大 的淋巴结，进行细菌培养的压印及涂片，然后置于无菌的容器中。 5.5 胸腔样本采集 5.5.1 自剑突下剪开胸腔，剪断肋骨，将胸骨翻起暴露胸腔，观察心、肺有无病变。 5.5.2 剪取心、肺部分组织，采集的脏器样品进行细菌培养的压印及涂片后，分别置无菌容器中。 5.6 腹腔样本采集 5.6.1 剪开腹壁，暴露腹腔，不应剪破肠腔，观察肝、脾有无病变，及其他脏器及组织是否存在异常。 5.6.2 剪取小块肝、脾组织，以及其他出现病变的脏器组织，分别置于无菌容器内。 5.7 其他组织样本采集 如果鼠尸已开始腐败，则应剥离四肢肌肉，分离出一条长骨，在接近骺端处剪断，取骨髓样本，或 打开颅腔，取脑组织。 5.8 蚤类样本采集 5.8.1 自毙鼠和染病萎靡鼠应单只单独梳捡收集蚤类。正常捕获鼠可同地点、同时间、同鼠种分组收 2 DB15/T 2265.2—2021 集，每组数量小于等于 20 匹。置于盛有 1：20 万的龙胆紫或 2 %氯化钠溶液的透明玻璃瓶内备用，注 明寄主、采集地点、采集日期。 5.8.2 将蚤从玻璃瓶取出，置于玻璃研磨器中加入适量无酶水，研磨至混悬液状态，4 ℃储存备用。 6 鼠疫细菌学检测 6.1 检测样本 依据本部分中鼠疫检验材料采集中的方法，采集动物样本、媒介样本及其它检材。 6.2 检测方法 6.2.1 镜检 6.2.1.1 涂片 无菌操作剪取腺、肝、脾、肺、心，用切面在洁净玻片上压印或涂成薄片；液体样本用接种环直接 涂片。每份样本至少制备2张涂片，自然干燥后，用95 %酒精固定15 min，取出自然干燥待染色。 6.2.1.2 染色 2张涂片，分别进行革兰氏染色和美兰染色。 6.2.1.3 镜检 待染色的样本片干燥后，显微镜下观察细菌染色及形态，并记录镜检结果。鼠疫菌为革兰氏阴性菌， 经革兰氏或美兰染色后为两极浓染两端钝圆的短小杆菌。 6.2.2 鼠疫菌分离培养 6.2.2.1 培养基条件 根据待测样本的新鲜程度选用不同的培养基进行分离培养。新鲜材料宜使用赫氏琼脂培养基，可能 有污染或腐败材料宜使用龙胆紫（1：10万～1：20万）赫氏琼脂培养基或耶尔森选择培养基，培养基pH 应控制在6.9～7.1之间。 6.2.2.2 脏器样本 用灭菌剪刀剪出切面，压印到培养基表面，用接种环按三段法划线。也可用接种环在脏器切面中心 钩取被检材料接种在平板上，划线培养。 6.2.2.3 骨髓样本 在断端用注射器抽取骨髓或用生理盐水注入冲洗，吸取冲洗液一滴到平板上再划线培养。 6.2.2.4 蚤类样本和液体样本 可直接用接种环钩取样本，接种在平板上划线培养。 6.2.2.5 必要时，各种材料同时应接种两个平板，一个用做分离鼠疫菌，另一个做鼠疫噬菌体快速诊 断。 3 DB15/T 2265.2—2021 6.2.2.6 已接种的培养基应置 28 ℃温箱中培养。培养物每天观察一次。如未出现严重污染，动物材 料连续观察 3 d，昆虫材料连续观察 4 d。观察中发现疑似鼠疫菌，应即时进行纯分离，并同时进行噬 菌体裂解试验。 6.2.3 噬菌体裂解试验 6.2.3.1 常规方法 凡发现疑似鼠疫菌，应钩取疑似菌落接种于培养基上划线培养，用注射器或毛细吸管吸取鼠疫噬菌 体一滴在平板划线上部使其垂直流下，然后置28 ℃培养24 h观察结果，如出现噬菌斑或菌带即可判为 鼠疫噬菌体裂解试验阳性。 6.2.3.2 噬菌体快速诊断 凡要做噬菌体快速诊断的材料，被检材料要接种两个平板，其一做分离鼠疫菌用，另一接种后即时 滴入鼠疫噬菌体做噬菌体试验，然后置28 ℃培养24 h观察结果，如出现菌斑或噬菌带即可判为鼠疫噬 菌体试验阳性。 7 检测抗体 7.1 样本类型 血清。 7.2 方法 可选择间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析化、化学发光法中任何一种方法进行。 具体操作方法按照试剂盒操作说明进行。 8 检测抗原 8.1 样本类型 宿主动物的脏器。 8.2 方法 可选择反相间接血凝试验、 酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析、化学发光法中任何一种方法进行。 具体操作方法按照试剂盒操作说明进行。 9 检测鼠疫菌特异性基因 9.1 样本处理 9.1.1 取样 与鼠疫菌分离采取同样的样本 ，如需长距离运送样本时，样本中可加入3倍量的95 %酒精进行浸泡。 4 DB15/T 2265.2—2021 9.1.2 研磨 将组织样本或蚤置玻璃研磨器中，加等体积蒸馏水，研磨制成匀浆，置微型离心管中，封闭管口， 置沸水浴中加热10 min，取上清作为核酸检测中的待检样本。也可采用DNA提取试剂盒进行核酸提取。 蚤类样本与组织样本处理方法相同。 9.2 检测方法 9.2.1 PCR 检测 9.2.1.1 引物 PCR方法可以选择检测鼠疫菌特异基因fra1或pla为目标。 目标基因 引物序列 fra1 上游 5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3 下游 5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3 pla 上游 5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3 下游 5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3 产物长度 249bp 456bp 9.2.1.2 反应体系 一次总量25 μL的反应混合物如下： ——蒸馏水 ——PCR Taq Mix （2×） ——引物上/下 游（10μmol/L） ——待测模板 10.5μL； 12.5μL； 各 1μL； 1μL。 注1：混合，短暂离心。 注2：反应应该设立质控参数：如阴性对照无菌水；阳性对照已知鼠疫阳性模板或阳性标准品。加样顺序：首先加 入阴性对照管，然后加样本模板，最后加入阳性对照。 9.2.1.3 扩增条件 9.2.1.3.1 预变性 95 ℃，5 min，1 个循环。 9.2.1.3.2 变性 95 ℃，1 min，退火 55 ℃，1 min，延伸 72 ℃，1 min，30 个循环。 9.2.1.3.3 完成 72 ℃ 延伸 5 min。 9.2.1.4 电泳检测及结果判读 制备1 %琼脂糖凝胶放入电泳槽电泳。预期扩增片段大小： fra1：249 bp，pla：456 bp，阴阳性 参考均正常的条件下，PCR产物片段的大小应与预计的一致，判定为扩增阳性。 9.2.1.5 测序 将PCR扩增产物进行测序分析，将获得序列，与Genbank数据库相应序列进行比对。 9.2.2 荧光定量