ICS 65.020.99 CCS B 39 12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 1067—2021 淡水小球藻生产技术规程 Technical regulations for production of freshwater Chlorella sp. 2021 - 08 - 16 发布 2021 - 09 - 16 实施 天津市市场监督管理委员会 发 布 DB12/T 1067—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。 本文件起草单位：天津市农业科学院。 本文件主要起草人：张峰峰、谢凤行、周可、赵琼、李瑞环、赵玉洁、孙海波、王姝、张越、高晶 琳、张新建。 I DB12/T 1067—2021 淡水小球藻生产技术规程 1 范围 本文件规定了淡水小球藻（Chlorella sp.）培养的环境、设备、水、培养方法、采收及注意事项。 本文件适用于淡水小球藻生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 5749 生活饮用水卫生标准 SL 733 内陆水域浮游植物监测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 原藻种 the original microalgae species 由单藻落分离纯化，并在固体斜面培养基上繁殖保存的藻种。 3.2 液体藻种 the liquid microalgae species 原藻种在固体平板培养基上活化，挑取单藻落接种至装有灭菌液体培养基的透明容器中，光照培养 的藻种。 4 生产用水和设施设备 4.1 生产用水 生产用水应符合地表水环境质量标准GB 5749中水质要求。 4.2 设施设备 4.2.1 藻种保藏室 放置冰箱、冰柜，保存原藻种的房间。 4.2.2 藻种培养室 进行培养基的配制和藻种的保种、培养及检查等操作的房间。配有分光光度计、电子天平（精度为 0.01 g）、光学显微镜（1000×）、照度计（精度为0.1 lx）超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温光照 培养箱等。 4.2.3 规模生产车间 1 DB12/T 1067—2021 进行藻液规模培养。配有光照设备和不同容量的透明发酵容器等。 5 生产技术流程 5.1 生产流程 生产流程应按附录A执行。 5.2 藻种质量 用于培养的藻种应有藻种鉴定报告或藻株来源相关信息。 规模生产之前需检测藻种的细胞密度和纯度，不能有其他藻污染，藻细胞密度≥1×107 cells/mL， 利用平板涂布法或计数框计数法测定藻细胞密度，计数框计数法应按SL 733中6.4的规定执行。 5.3 培养基 小球藻液体培养基配方见附录B。保种固体培养基和计数培养基为在液体培养基中加入20 g/L琼脂 粉。 5.4 灭菌消毒 保种斜面培养基，生产液体藻种培养基以及计数培养基采用高压蒸汽灭菌，灭菌条件为110 ℃～ 115 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa，灭菌10 min～15 min。 规模培养容器用10 mg/L～20 mg/L高锰酸钾溶液或有效氯浓度为0.1‰～0.3‰次氯酸钠溶液浸泡12 h～24 h。消毒后，用清水洗净。检查无杂藻杂物后，加水和培养基。也可加入水和培养基后进行高压 蒸汽灭菌，灭菌条件为110 ℃～115 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa，灭菌10 min～15 min。 5.5 液体藻种培养 5.5.1 容器 容器为200 mL～500 mL透明玻璃瓶，可高压蒸汽灭菌。 5.5.2 培养条件 从斜面培养基接种原藻种到液体培养基中，光照强度3 000 lx～5 000 lx，光照周期14L:10D，培 养温度20 ℃～25 ℃，静置培养7 d～10 d。 5.5.3 质量检测 配制计数培养基，利用平板涂布法测定小球藻细胞密度及纯度。 7 小球藻细胞密度≥1×10 cells/mL，其他藻类密度＜0.1‰，即为合格藻种。 5.6 规模培养 5.6.1 容器 容器容积控制在0.2 m³～2 m³，高度≤100 cm。选用透光性强的塑料桶、塑料袋、玻璃缸等适合的 培养容器。 5.6.2 接种量 按培养体积的10%～20%接种液体藻种。 2 DB12/T 1067—2021 5.6.3 光照 光照强度4 000 lx～20 000 lx。 5.6.4 温度 温度为15 ℃～30 ℃，最适培养温度为20 ℃～25 ℃。 5.6.5 培养方式 规模培养应适当补充空气，充气量应大于培养容积的1%。 5.6.6 培养周期 最适培养条件下，一个培养周期为7 d～10 d。 5.7 生长监测 每天采样监测，用计数框计数法或光密度法计算藻细胞密度，观察污染情况。 5.8 污染控制 在培养的生产过程中，应注意避免污染，定期检查藻细胞的生长状况，如发现有黄化、黑化、浮游 动物或其他藻类污染，应终止培养，清洗消毒，重新接种。 5.9 质量检测 7 利用平板涂布法测定小球藻细胞密度，藻细胞密度≥1×10 cells/mL，其他藻类密度＜1%即为合格。 5.10 后处理 藻液培养完毕，直接分装。 6 生产记录 6.1 生产、加工过程记录 应记载藻种来源、培养日期、培养时间、灌装日期、藻液颜色、藻细胞密度、温度等。 6.2 培养基采购、使用记录 应记载培养基进货日期、名称、规格、批号、数量、供货商、索证情况、保质期限、验收人记录、 培养基使用量等。 6.3 记录保存 生产记录应保存不少于2年。 7 储存 分装后的藻液应贮存在通风、干燥、清洁的仓库，仓库内无有害气体、易燃易爆物品及有腐蚀性的 化学物品，远离热源。 3 DB12/T 1067—2021 A A 附 录 A （规范性） 淡水小球藻生产流程图 淡水小球藻生产流程见图A.1 图A.1 淡水小球藻生产流程 4 DB12/T 1067—2021 B B 附 录 B （资料性） 淡水小球藻培养基 淡水小球藻培养基配方如下： ——NaNO3 1.5 g； ——K2HPO4 0.04 g； ——MgSO4·7H2O 0.075 g； ——CaCl2·7H2O 0.036 g； ——Na2CO3 0.02 g； ——柠檬酸 0.006 g； ——柠檬酸铁铵 0.006 g； ——EDTA 0.001 g； ——微量元素溶液 A5 1 mL； ——氨苄青霉素 (终浓度) 50 μg/mL； ——蒸馏水/自来水 1 L。 其中，微量元素溶液 A5 配方： ——H3BO3 2.86g； ——MnCl2·4H2O 1.81g； ——ZnSO4·7H2O 0.222g； ——Na2MoO4 0.39g； ——CuSO4·5H2O 0.079g； ——Co(NO3)2·6H2O 0.049g； ——蒸馏水 1L。 5