(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210686786.1 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 华中科技大 学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037号 申请人 湖北光谷实验室 (72)发明人 付玲　焦振飞　 (74)专利代理 机构 华中科技大 学专利中心 42201 专利代理师 尹丽媛 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) G01B 11/24(2006.01) G06F 17/15(2006.01)G06T 17/00(2006.01) (54)发明名称 选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光 成像方法和系统 (57)摘要 本发明属于显微 成像技术领域， 具体涉及一 种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光成 像方法和系统， 包括采用光束整形器件， 将入射 平行的光束， 整形成与待成像区域形状相同的光 束， 选择性地只照亮待成像区域， 以激发样本所 需深度位置的荧光； 通过在成像物镜和荧光相机 之间， 引入均与成像物镜后 焦面共轭的可调孔径 光阑和相位调制器件， 分别来改变成像物镜的有 效数值孔径和物镜后 焦面的相位分布， 进而改变 成像物镜的点扩散函数； 根据被调制成的特定的 点扩散函数， 以及相机上收集到的所需深度位置 荧光信号的叠加图像， 进行三维重建， 得到样本 的原始三维结构。 本发明可选择性只照明和探测 所感兴趣深度范围的荧光， 有效提升三维图像重 建信噪比和对比度。 权利要求书3页 说明书13页 附图5页 CN 115184318 A 2022.10.14 CN 115184318 A 1.一种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧 光成像方法， 其特 征在于， 包括： 采用光束整形器件， 将入射平行的光束， 整形成与待成像区域形状相同的光束， 选择性 地只照亮待成像区域， 以激发样本所需深度位置的荧 光； 通过在成像物镜和荧光相机之间， 引入均与成像物镜后焦面共轭的可调孔径光阑和相 位调制器件， 分别来改变所述成像物镜的有效数值孔径和物镜后焦面的相位分布， 进而改 变成像物镜的点扩散函数； 其中， 所述可调孔径 光阑位于所述成像物镜后方， 且与成像物镜 的后焦面共轭， 用于改变所述成像物镜的有效数值孔径， 从而根据所需探测 位置改变点扩 散函数的轴向连续覆盖范围； 所述相位调制器件位于所述可调孔径光阑的后方， 且同时与 所述成像物镜的后焦面和可调孔径光阑共轭， 用来改变成像物镜后焦面的相位分布， 从而 根据所需探测位置强化 或弱化点扩散函数的部 分轴向覆盖范围； 所述成像物镜位于样本上 方， 用于基于被调制成的特定的点扩散函数， 收集所述所需深度位置的荧 光信号； 根据被调制成的特定的点扩散函数， 以及相机上收集到的所需深度位置荧光信号的叠 加图像， 进行三维重建， 得到样本的原 始三维结构。 2.根据权利要求1所述的一种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光成像方法， 其 特征在于， 所述选择性 地只照亮待成像区域， 实现方式为： 扩大激发荧光所需的光源光斑尺寸， 均匀照亮光束整形器件； 所述光束整形器件产生 选择性照亮所需深度位置样本的光束； 将光束整 形器件产生的光束缩小共轭到样本腔中激 发样本荧 光。 3.根据权利要求2所述的一种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光成像方法， 其 特征在于， 所述光束整 形器件为数字微反射镜阵列， 其通过调制光 强分布， 产生选择性照亮 所需深度位置样本的光束。 4.根据权利要求1至3任一项所述的一种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光成 像方法， 其特 征在于， 所述相位调制器件具体为空间光调制器或可变形镜 。 5.根据权利要求1至3任一项所述的一种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光成 像方法， 其特 征在于， 所述改变成像物镜后焦面的相位分布， 具体实现方式为： 根据所需探测的样本深度 范围， 得到所需的具有多个子焦点的点扩散函数， 其中， 所述 多个子焦点均匀分布于所述深度范围内； 所述具有多个子焦点的点扩散函数中每个子焦点 i对应的特 征为： PSFi＝Wx‑倾 斜PSFx‑倾 斜+Wy‑倾 斜PSFy‑倾 斜+Wz‑离焦PSFz‑离焦； 其中， Wx‑倾斜和Wy‑倾斜分别为控制子焦点在x,y轴方向倾斜程度PSFx‑倾斜、 PSFy‑倾斜的权重； Wz‑离焦为控制子焦点在z轴方向离焦程度PSFz‑离焦的权重； 改变权重Wx‑倾斜和Wy‑倾斜， 以改变子焦 点倾斜程度， 捕 获样本角空间信 息； 改变权重Wz‑离焦， 以针对所需探测的样本深度 范围， 配置 子焦点位置； 利用傅里叶光学理论， 通过为相位调制器件上每个子孔径区域分配不同的权重， 进行 区域子孔径相位合成， 最终生成相位调制 器件上所需的相位分布， 以用于实现所述所需的 具有多个子焦点的点扩散函数， 其中， 每 个子孔径区域相位表示 为 其中， 和 分别为控制每个子孔径区域 中两个维度倾斜项 和 以及离焦项 的相位所占的权重大小， 和 为泽尼权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115184318 A 2克多项式 中n和m取不同数值情况 下的表达式； 根据所述所需的相位分布， 改变加载到空间光调制器上面每个像素上的 电压， 进而改 变该像素对 入射光的相位延迟， 从而调制成像物镜后焦面的相位分布。 6.一种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光成像系统， 其特征在于， 包括： 选择区 域照明装置， 选择区域成像装置， 以及成像结果处 理装置； 所述选择区域照明装置用于采用光束整形器件， 将入射平行的光束， 整形成与待成像 区域形状相同的光束， 选择性 地只照亮待成像区域， 以激发样本所需深度位置的荧 光； 所述选择区域成像装置包括成像物镜、 可调孔径光阑和相位调制器件； 所述可调孔径 光阑位于所述成像物镜后方， 且与成像物镜的后焦面共轭， 用于改变所述成像物镜的有效 数值孔径， 从而根据所需探测位置改变点扩散函数 的轴向连续覆盖范围； 所述相位调制器 件位于所述可调孔径光阑的后方， 且同时与所述成像物镜的后焦面和可调孔径光阑共轭， 用来改变成像物镜后焦面的相位分布， 从而根据所需探测位置强化或弱化点扩散函数的部 分轴向覆盖范围； 所述成像物镜位于样本上方， 用于基于被调制成的特定的点扩散函数， 收 集所述所需深度位置的荧 光信号； 所述成像结果处理装置用于根据被调制成的特定的点扩散函数， 以及相机上收集到的 所需深度位置荧 光信号的叠加图像， 进行三维重建， 得到样本的原 始三维结构。 7.根据权利要求6所述的一种选择性照明和探测任意深度范围的3D荧光成像系统， 其 特征在于， 所述选择区域照明装置包括： 激光器， 激光扩束 单元， 光束调制单元， 以及光束中 继单元； 所述激光器用于提供激发荧 光所需的光源； 所述激光扩束单 元用于扩大 所述光源的光斑尺寸， 均匀照亮所述 光束调制单 元； 所述光束调制单元用于通过调制光强分布， 产生选择性照亮所需深度位置样本的光 束； 所述光束中继单元用于将所述光束调制单元产出的选择性照亮所需深度位置样本的 光束缩小共 轭到样本腔内， 选择性 地激活所述所需深度位置的样本 。 8.根据权利要求6或7所述的一种选择性照明和探测任意深度 范围的3D荧光成像系统， 其特征在于， 所述选择区域 成像装置包括： 成像物镜， 中继透镜组1， 可调孔径 光阑， 偏振片， 中继透镜组2， 相位调制器件， 以及相机； 所述成像物镜用于收集样本被激发的、 来自不同深度的荧 光信号； 所述中继透镜组1， 用于将 成像物镜的后焦面共轭到可调孔径光阑表面， 并提供放大倍 数， 使得物镜后焦面的尺寸在可调孔径光阑的有效范围内； 所述偏振片用于将不具有偏振态的荧光， 变成具有单一偏振态的偏振光， 并使得其偏 振方向平行于相位调制器件的光轴， 从而可以被相位调制器件进行相位调制； 所述中继透镜组2用于将与物镜后焦面共轭的可调孔径光阑的平面进一步共轭到相位 调制器件表面， 从而使得三个平面互相共轭； 通过改变加载到相位调制 器件上每个像素 的 电压， 对成像物镜的后焦面进行相位调制， 从而改变成像物镜点扩散函数的形状； 所述相机用来接收最终来自样本不同深度且卷积了各深度对应点扩散函数的荧光信 号。 9.根据权利要求6或7所述的一种选择性照明和探测任意深度 范围的3D荧光成像系统，权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115184318 A 3