(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211160790.0 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 南京工业大 学 地址 211800 江苏省南京市浦口区浦珠南 路30号 (72)发明人 张志刚　王旻宇　纪晓俊　童琦　 慎立群　 (74)专利代理 机构 南京业腾知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32321 专利代理师 李静 (51)Int.Cl. C12P 7/625(2022.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/085(2006.01) (54)发明名称 一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3-羟基丁酸 酯的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用蜡状芽孢杆菌制备 聚3‑羟基丁酸酯的方法， 将蜡状芽孢杆菌菌株 TQ‑0513‑2接种至种子培养基， 30℃培养12h， 获 得种子液， 将种子液 以体积浓度1％的接种量接 种至无机盐培养基， 震荡培养后， 离心弃上清， 收 集湿菌体， 将湿菌体进行提纯， 得到聚3 ‑羟基丁 酸酯。 本发明方法中， 采用的菌株能够高效稳定 地利用葡萄糖、 麦芽糖和甘油等为碳源， 在细胞 内大量积累聚3 ‑羟基丁酸酯， 最高含量可占细胞 干重的56.2％。 该菌株在生物合成聚3 ‑羟基丁酸 酯中具有潜在的应用价值。 本发 明中涉及的菌株 在聚3‑羟基丁酸酯的制备中具有良好的工业应 用前景。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115386605 A 2022.11.25 CN 115386605 A 1.一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)将蜡状芽孢杆菌 接种至种子 培养基， 30℃培养12h， 获得种子液； (2)将种子液以体积浓度1％的接种量接种至无机盐培养基， 震荡培养后， 离心弃上清， 收集湿菌体； (3)将湿菌体进行提纯， 得到聚3 ‑羟基丁酸酯； 步骤(1)中， 所述蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus  cereus)菌株TQ ‑0513‑2， 已 保藏于中国典型培养物中心， 保藏编号为CCTCC  NO:M 2020433， 保藏日期为2020年9月2日， 保藏地址为中国武汉， 武汉大 学； 步骤(2)中， 所述无机盐培养基的配方为： 碳源20 ‑25g/L； 磷酸氢二钠2800mg/L； 磷酸二 氢钾1000mg/L； 硫酸铵500mg/L； 氯化镁53mg/L； 四水钙盐50mg/L； ED TA二钠0.5mg/L； 七水合 硫酸亚铁0.2mg/L； 七水硫酸锌0.01mg/L； 四水氯化锰0.003mg/L； 硼酸0.03mg/L； 六水氯化 钴0.02mg/L； 二水氯化铜0.001mg/L； 六水氯化镍0.002mg/L； 二水钼 酸钠0.003mg/L， pH为 7.0。 2.如权利要求1所述利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述种子培养基为LB培养基， 其组成为： 氯化钠10.0g/L， 酵母提取物5.0g/L， 蛋白胨 10.0g/L， 溶剂为水， pH值 为7.0。 3.如权利要求1所述利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述无机 盐培养基的配方中， 碳源为酵母提取物、 葡萄糖、 甘油、 阿拉伯糖、 麦芽糖中 的一种或几种。 4.如权利要求3所述利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 其特征在于， 所述 无机盐培 养基的配方中， 碳源为酵母提取物和葡萄糖。 5.如权利要求1所述利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述震荡培 养的条件为： 3 0℃， 200r/min培养24h。 6.如权利要求1至5任一项所述利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 其特征 在于， 步骤(3)中， 所述提纯方法为： 湿菌体经液氮反复冻融， 离心后， 沉淀用蒸馏水和丙酮 各洗涤2次， 最后70℃烘干， 得到聚3 ‑羟基丁酸脂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386605 A 2一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方 法 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸 酯的方法。 背景技术 [0002]聚3‑羟基丁酸酯具有良好的生物降解性和生物相容性， 被认为是医疗、 农业和食 品包装等传统塑料 的有效替代品。 聚3 ‑羟基丁酸脂作为可降解生物基塑料， 具备与聚乙烯 等传统石油基塑料相似的物理性质， 对于减少常规塑料 “白色污染 ”和推动社会 可持续发展 方面具有重要应用价 值。 [0003]目前， 聚3 ‑羟基丁酸酯的生产主要采用的是生物发酵法。 聚3 ‑羟基丁酸酯可由微 生物在碳源和氮源失衡条件下， 在细胞内积累贮存， 当碳源贫乏时可被重新利用作为细胞 生长的碳源和能源。 目前， 已发现约66个菌属 300多种微生物能够产聚3 ‑羟基丁酸酯， 但合 成效率比较低， 生产成本比较高。 因此， 迫切需要筛选出聚3 ‑羟基丁酸酯高产率菌株， 以提 高聚3‑羟基丁酸酯生物合成效率， 并降低生产成本 。 发明内容 [0004]本发明的目的在于解决现有生物发酵法生产聚3 ‑羟基丁酸酯存在的不足， 提供一 种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 本发明利用筛选的蜡状芽孢杆菌 (Bacillus  cereus)TQ ‑0513‑2发酵生产聚3 ‑羟基丁酸酯， 该菌生长过程中可在细胞内积累 聚3‑羟基丁酸酯， 并且产量高， 工艺简单。 [0005]本发明的技 术方案为： [0006]一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3 ‑羟基丁酸酯的方法， 包括如下步骤： [0007](1)将蜡状芽孢杆菌 接种至种子 培养基， 30℃培养12h， 获得种子液； [0008](2)将种子液以体积浓度1％的接种量接种至无机盐培养基， 震荡培养后， 离心弃 上清， 收集湿菌体； [0009](3)将湿菌体进行提纯， 得到聚3 ‑羟基丁酸酯。 [0010]步骤(1)中， 所述蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus  cereus)菌株TQ ‑0513‑ 2， 已保藏于中国典型培养物中心， 保藏编号为CCTCC  NO:M 2020433， 保藏日期为2020年9月 2日， 保藏地址为中国武汉， 武汉大学。 该菌株是从土壤中分离筛选获得， 经检测， 其在生长 过程中具有在 细胞内积累聚3 ‑羟基丁酸酯的能力。 [0011]步骤(2)中， 所述无机盐培养基的配方为： 碳源20 ‑25g/L； 磷酸氢二钠2800mg/L； 磷 酸二氢钾1000mg/L； 硫酸铵500mg/L； 氯化镁53mg/L； 四水钙盐50mg/L； EDTA二钠0.5mg/L； 七 水合硫酸亚铁0.2mg/L； 七水硫酸锌0.01mg/L； 四水氯化锰0.003mg/L； 硼酸0.03mg/L； 六水 氯化钴0.02mg/L； 二水氯化铜0.001mg/L； 六水氯化镍0.002mg/L； 二水钼酸钠0.003mg/L， pH 为7.0。 [0012]进一步， 步骤(1)中， 所述种子培养基为LB培养基， 其 组成为： 氯化钠10.0g/L， 酵母说　明　书 1/4 页 3 CN 115386605 A 3