(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211162541.5 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 南京工业大 学 地址 211816 江苏省南京市江北新区浦珠 南路30号 (72)发明人 郝宁　张敏　郭格格　李涛　 刘兆星　欧阳平凯 　 (74)专利代理 机构 南京新慧恒 诚知识产权代理 有限公司 32424 专利代理师 王月霞 (51)Int.Cl. C12N 9/56(2006.01) C12N 9/54(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01)C12R 1/10(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用火麻籽粕固态发酵 生产纳豆激酶的方法， 利用火麻籽粕作为唯一基 质， 将纳豆激酶生产菌接种于该固体培养基上， 控制温度在30 ‑40℃， 湿度在60 ‑80℃， 发酵16 ‑24  h， 纳豆激酶的产酶量达到9592.8IU/g。 本发明利 用榨油废弃物火麻籽粕作为唯一发酵基质， 极大 地降低了纳豆激酶生产成本， 简化了发酵过程， 同时实现了火麻籽粕的高价值利用。 火麻籽清香 味很好地中和了纳豆激酶发酵过程中产生的氨 味， 使纳豆激酶更易被接受。 该方法是首次使用 火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶， 为纳豆激酶的 生产的提供了新方法， 具有广阔应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 CN 115404227 A 2022.11.29 CN 115404227 A 1.一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆 激酶的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1) 将火麻籽粕进行粉碎， 加入一定量的蒸馏水进行浸泡； 2) 将浸泡后的火麻籽粕进行灭菌； 3) 将纳豆激酶生产菌 接种在冷却的火麻籽粕上， 控制发酵温度、 湿度， 进行固态发酵； 4) 将发酵后的产物加入一定量的蒸馏水进行浸提离心得到纳豆 激酶。 2.根据权利要求1所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 步骤1） 将火麻籽粕进行粉碎， 加入1∶ （1 ‑5） （w/v， g/mL） 的蒸馏水浸泡2 ‑5 h。 3.根据权利要求1所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 步骤2） 将火麻籽粕进行高压蒸汽进行灭菌， 控制 温度在100 ‑120℃， 灭菌时间为20 ‑30  min。 4.根据权利要求1所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 步骤3） 所述的纳豆激酶生产菌包括枯草芽孢杆菌 （ Bacillus  subtilis ） CGMCC  No.13932、 纳豆芽孢杆菌 （ Bacillus  natto） BNCC194961、 地衣芽孢杆菌 （ Bacillus   licheniformis ） BNCC132622 中的至少一种。 5. 根据权利要求1所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 步骤3） 按5 ‑15％的种子液接种量， 将产纳豆激酶生产菌种子液接入发酵培养基中， 并搅 拌， 培养温度 30‑40℃， 培养箱湿度 60‑80％ ， 发酵16‑24 h。 6.根据权利要求1所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 步骤4） 加入1∶ （5 ‑10） （w/v， g/mL） 的蒸馏水浸提2 ‑5 h， 10000‑12000 r/min离心10 ‑20  min， 离心上清液进行纳豆 激酶活性检测。 7.根据权利要求5所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 纳豆激酶生产菌接种顺序为枯草芽孢杆菌CGMCC  No.13932先接种到培养基中， 培养温 度30‑40℃， 培养箱湿度60 ‑80％， 发酵16 ‑24 h后再接入纳豆芽孢杆菌BNCC194961和/或地 衣芽孢杆菌 （ Bacillus licheniformis） BNCC132622继续发酵16 ‑24 h。 8.根据权利要求5所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 步骤2） 中灭菌后的火麻籽粕中加入蛋白酶进行酶解。 9.根据权利要求8所述的一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 其特征在 于， 所述蛋白酶为中性蛋白酶、 碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶中的任意一种， 酶解温度40~55℃， 蛋白酶加入量 为5~10%。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115404227 A 2一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物发酵技术领域， 具体涉及 一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激 酶的方法。 技术背景 [0002]火麻籽因其具有50％左右的丰富油脂， 且富含不饱和脂肪酸， 常通过压榨方式制 作成火麻油。 而制作火麻油产生的火麻籽粕常常作为加工废弃物被直接丢弃， 或者以极低 的价格卖作动物饲料。 这对有限的火麻资源来说是以一种极大 的浪费。 火麻籽粕中含有约 60％粗蛋白、 20％膳食纤维、 7％～8％脂类、 10％碳水化合物， 以及 多种维生素和矿物质等， 是优秀的碳源， 此前对于火麻籽粕的利用较少， 目前还没有将其作为固体发酵基质来进行 微生物的培养。 将火麻籽粕作为唯一 发酵基质来生产纳豆激酶， 实现了废弃物的高效利用， 降低了纳豆 激酶的生产成本， 实现了变废为宝。 [0003]纳豆激酶(nattokinase， NK)是一种丝氨酸蛋白酶， 将纳豆激酶添加在食品中， 通 过食用降低人体中血液和血浆的粘度， 达到预防和治疗血栓性疾病的目的。 与现有的纤溶 酶相比， 纳豆激酶因具有高溶纤活性、 无副作用、 更易被人体 吸收等优点而备受关注。 但纳 豆激酶需求量大， 产量低、 成本高的特点阻碍其广泛应用。 提高纳豆激酶产量和活性一直是 推进纳豆 激酶发展的重点。 [0004]在专利201110034654.2 《一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激 酶的方法》 中记 载， 在 用含有乳糖和葡萄糖的营养液浸泡鹰嘴豆后， 用其进行固态发酵， 纳豆激酶粗酶液活性为 3270IU/g。 在专利200910040896.5 《一种纳豆激酶固体发酵方法》 中记载， 以大豆作为固体 发酵基质， 所产纳豆激酶酶活为700IU/g。 在专利  200810231137.2 《一种纳豆激酶固体发酵 方法》 中记载， 以豆渣作为固体发酵基质， 单位发酵酶活高达 5311.72IU/g。 [0005]专利202210267411.1 《一种火麻籽粕高F值寡肽及其制备方法和在提高纳豆激酶 产量中的应用》 中以火麻籽粕作为原料， 先分离制备得到高F值火麻籽粕寡肽， 加入到枯草 芽孢杆菌的发酵液中， 可显著 提高其纳豆激酶的产量， 但是需要对火麻籽粕先进 行处理， 工 序复杂。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法， 该方法 过程简单， 且生产的纳豆激酶的活性高， 且可有效利用榨油废弃物火麻籽粕， 降低了生产成 本且实现了火麻籽粕的高效利用。 此外， 火麻籽粕固态发酵时间短， 在20h左右纳豆激酶活 性就达到最高， 减少 了发酵时间。 与其他固态发酵基质相比， 火麻籽粕气味清香， 能够中和 发酵过程中产生的氨味， 使纳豆 激酶更易被接受。 [0007]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方法如下： [0008]一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆 激酶的方法， 包括如下步骤： [0009]1)将火麻籽粕进行粉碎， 加入一定量的蒸馏水进行浸泡；说　明　书 1/8 页 3 CN 115404227 A 3