(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211156743.9 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 成都川哈工 机器人及智能装备产业 技术研究院有限公司 地址 610000 四川省成 都市中国 （四川） 自 由贸易试验区成都高新区天府大道北 段966号天府国际金融中心四号楼5层 【40530-40543】 号 申请人 成都潮富生物科技有限公司 (72)发明人 邹孟君　刘辉　何骞　申伟　 张少恩　 (74)专利代理 机构 成都行之专利代理事务所 (普通合伙) 51220 专利代理师 唐邦英(51)Int.Cl. C12N 1/36(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12R 1/25(2006.01) (54)发明名称 一种从酸蜂蜜中分离 乳酸菌的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌 的方法， 包括以下步骤： S1、 将酸蜂蜜进行稀释处 理获得菌液； S2、 将步骤S1获得的菌液接种于乳 酸菌液体培养基中， 进行多轮驯化培养， 获得待 分离菌液， 其中， 驯化培养为： 于34 ‑37℃条件下 进行震荡培养； S3、 将步骤S2获得的待分离菌液 经稀释后， 涂布于含有CaCO3的乳酸菌分离固体 培养基上， 进行倒置培养。 本发明通过一种特殊 驯化方法成功本从酸蜂蜜中提取出乳酸菌， 该菌 株是有益菌， 可广泛应用到食品及人体中。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115322943 A 2022.11.11 CN 115322943 A 1.一种从酸蜂蜜中分离 乳酸菌的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 将酸蜂蜜 进行稀释处 理获得菌液； S2、 将步骤S1获得的菌液接种于乳酸菌液体培养基中， 进行多轮驯化培养， 获得待分离 菌液， 其中， 驯化培 养为： 于34‑37℃条件下进行震荡培 养； S3、 将步骤S2获得的待分离菌液经稀释后， 涂布于含有CaCO3的乳酸菌分离固体培养基 上， 进行倒置 培养。 2.根据权利要求1所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 步骤S1中， 采用生理盐水进行稀释。 3.根据权利要求2所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 步骤S1中， 酸蜂蜜的具体稀释过程 为： 将酸蜂蜜置 于0.9％生理盐水中稀释培 养24h， 酸蜂蜜和生理盐水的重量比为1:10 0。 4.根据权利要求1所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 步骤S2中， 震荡培养的转速为6 0‑80rpm。 5.根据权利要求1所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 步骤S2中， 驯化培养8‑12轮， 每轮时间为24h 。 6.根据权利要求1所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 乳酸菌培养 基的pH为6.2 ‑6.4。 7.根据权利要求1所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 以质量百分 比计， 乳酸菌液体培 养基由以下组分组成： 蛋白胨1％， 牛肉膏1％， 酵母粉0.5％， 磷酸氢二钾0.2％， 柠檬酸氢二铵0.2％， 乙酸钠 0.5％， 葡萄糖2％， Twe en‑80 0.1％， MgSO4·7H2O 0.058g， MnSO4·4H2O 0.025g， 余 量为水。 8.根据权利要求1所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 步骤S3中， 待分离菌液采用生理盐水稀释8 ‑10倍。 9.根据权利要求1所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， 步骤S3中， 乳酸菌液体培 养基中含有CaCO3和琼脂。 10.根据权利要求9所述的一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 其特征在于， CaCO3和琼 脂在乳酸菌液体培 养基中的质量占比分别为2％和1.5％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115322943 A 2一种从酸蜂蜜中分离 乳酸菌的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及微 生物技术领域， 具体涉及一种从酸蜂蜜中分离 乳酸菌的方法。 背景技术 [0002]酸蜂属于无刺蜂属， 因所产的蜂蜜甜中带酸而得名酸蜂， 酸蜂蜜是由无刺蜂种里 面的酸蜂采集花粉与花蜜酿制加工成的天然蜂蜜， 酸蜂一般优先采集药用价值高的植物花 蜜， 因而具有较高的保健价值， 一般认为具有化积消食， 延缓衰老， 解毒安神及美容抗皱等 功效。 [0003]酸蜂蜜的原蜜中微生物的种类丰富， 主要包括酵母菌， 乳酸菌， 芽孢杆菌和红曲霉 等， 其中乳杆菌属是最常被用作益生菌微生物类群， 它为革兰氏阳性菌(G+)， 不产生芽孢， 细胞形态多 呈链杆状或球杆状， 多 数为兼性厌氧菌， 其主要发酵产 物为乳酸， 也有少数副产 物， 如钾酸、 乙酸、 琥珀酸、 CO2等。 常用于乳制品、 肉制品、 泡菜等的发酵 中， 且是人与其它动 物呼吸道、 胃肠道和泌尿生殖道微生物群落的重要组成部分， 乳酸菌还具有调节微生态平 衡、 增强肠屏障功能和调节免疫反应等有效效果。 传统的菌种分离方法工作量非常大且速 度缓慢。 [0004]因此， 开发一种快速从酸蜂蜜提取乳酸菌的方法是非常必要且有积极意 义的。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种从酸蜂蜜中分离乳酸菌的方法， 以实现从酸蜂蜜中成 功分离出乳酸菌， 且具有效率高和准确性高的优点。 [0006]本发明通过 下述技术方案实现： [0007]一种从酸蜂蜜中分离 乳酸菌的方法， 包括以下步骤： [0008]S1、 将酸蜂蜜 进行稀释处 理获得菌液； [0009]S2、 将步骤S1获得的菌液接种于乳酸菌液体培养基中， 进行多轮驯化培养， 获得待 分离菌液， 其中， 驯化培 养为： 于34‑37℃条件下进行震荡培 养； [0010]S3、 将步骤S2 获得的待分离菌液经稀释后， 涂布于含有CaCO3的乳酸菌分离固体培 养基上， 进行倒置 培养。 [0011]常规分离乳酸菌的方法在步骤S1(稀释)之后， 直接把混合菌液利用平板分离乳酸 菌， 效率非常低。 [0012]酸蜂蜜中的乳酸菌浓度含量较高， 直接分离很难得到单个菌落， 因此， 本发明的步 骤S1进行稀释处 理， 使分离后能够获得 单个菌落。 [0013]如果直接将稀释后的酸蜂蜜进行步骤S3的倒置培养， 由于酸蜂蜜的p  H在2到4之 间， 酸度高， 直接涂布于含有CaCO3的乳酸菌分离固体培养基上， 会直接水解CaCO3， 无法判断 哪些菌落产酸， 很难直接经 过步骤S3从酸蜂蜜中分离出乳酸菌 。 [0014]申请人通过 试验发现： [0015]先将稀释后的酸蜂蜜进行本发明步骤S2的多轮驯化培养， 再进行骤S3的倒置培说　明　书 1/6 页 3 CN 115322943 A 3