(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211171808.7 (22)申请日 2022.09.26 (71)申请人 天津科技大 学 地址 300457 天津市滨 海新区经济技 术开 发区第十三大街9号 (72)发明人 徐庆阳　陈志超　刘云鹏　 (74)专利代理 机构 天津市三利专利商标代理有 限公司 12107 专利代理师 李蕊 (51)Int.Cl. C12P 13/14(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/15(2006.01) (54)发明名称 一种发酵生产L- 谷氨酰胺的方法 (57)摘要 本发明提供了一种发酵生产L ‑谷氨酰胺的 方法， 使用NH4+限制发酵工艺和全营养分割强迫 发酵工艺， 提高L ‑谷氨酰胺产量和糖酸转化率， 缩短发酵周 期， 降低副产物谷氨酸含量， 从而降 低L‑谷氨酰胺的提取成本， 具有广泛的工业应用 前景。 权利要求书1页 说明书6页 CN 115505607 A 2022.12.23 CN 115505607 A 1.一种发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 其特 征在于： 具体步骤如下： (1)将谷氨酸棒杆菌接种到斜面培养基活化， 接入摇瓶利用种子培养基进行一级种子 培养； (2)一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养以及发酵培养， 发酵过程中NH4+限制发 酵工艺、 全营养分割强迫发酵工艺。 2.根据权利要求1所述的发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 其特 征在于： 具体步骤如下： (1)将谷氨酸 棒杆菌T‑6接种到斜 面培养基活化， 活化条件： 32℃， 12h； (2)将斜面活化 的菌种接入摇瓶进行一级种子培养， 34℃， pH7.0， 220rmp/min， 摇床培 养10h， 获得一级种子培养基体系； 一级种子液全部接入发酵罐内进 行二级种子培养， 34℃， pH7.0， 溶 氧30‑50％， 培养至OD600达到40， 获得二级种子 培养基体系； (3)每2L二级种子培养基体系中， 发酵初始培养基用水定容至1.3L； 发酵流加培养基定 容300mL； 当二级种子培养完成， 将二级种子液放出至剩余600mL， 加入提前配制并定容好的 1.3L发酵初始培养基和100mL浓度为80％的葡萄糖； 流加培养基从发酵4h开始流加至发酵 结束前8h； (4)将300g的(NH4)2SO4溶于600mL水中， 从发酵3 h开始均匀流加至发酵 结束； (5)种子培养基中添加的尿素用来调节种子培养阶段和发酵培养初期的pH， 1.5g/L的 尿素可以使种子培养阶段全程pH维持在7.0 ‑7.2， 并在发酵培养初期将pH维持在7.0 ‑7.2直 至pH开始自然下降， 开始使用25％的氨水调节发酵培 养过程中的pH值维持在6.4； (6)发酵过程中流加 补料的葡萄糖中加入3g/L甜菜碱， 各0.5mg/L的VB1、 3、 5、 12、 2g/L氯化 胆碱、 10mg/L赤霉素、 5mg/L磷酸吡哆醛。 3.根据权利要求2所述的发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 其特征在于： 所述斜面培养基 为： 牛肉膏10g/L、 酵母粉5g/L、 蛋白胨10g/L、 KH2PO4 1g/L、 MgSO4 0.5g/L、 N aCl 2.5g/L、 琼 脂粉25g/L。 4.根据权利要求2所述的发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 其特征在于： 所述种子培养基 为： 葡萄糖30g/L、 豆浓40mL/L、 K2HPO4·3H2O 2.5g/L、 MgSO4·7H2O 0.9g/L、 VH 20μg/L、 FeSO4 5mg/L、 MnSO4 5mg/L、 Vb1,3,5,12各0.5mg/L、 尿素1.5g/L。 5.根据权利要求2所述的发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 其特征在于： 所述发酵初始培养 基为： 葡萄糖30g/L、 K2HPO4·3H2O 3g/L、 Vb1,3,5,12各0.25mg/L、 豆浓50mL/L、 MnSO4 10mg/L、 FeSO4 10mg/L、 ZnSO4 5mg/L、 MgSO4·7H2O 2g/L、 VH 4 μg/L、 糖蜜1.1g/L。 6.根据权利要求2所述的发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 其特征在于： 所述发酵流加培养 基为： K2HPO4·3H2O 3g/L、 Vb1,3,5,12各0.25mg/L、 MnSO4 10mg/L、 FeSO4 10mg/L、 ZnSO4 5mg/L、 MgSO4·7H2O 2g/L、 糖蜜1.1g/L。 7.根据权利要求2所述的发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 其特征在于： 所述谷氨酸棒杆菌 T‑6是通过菌株CGM CC No.1.16145经 过基因改造得到的高产L ‑谷氨酰胺菌株。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115505607 A 2一种发酵生产L ‑谷氨酰胺的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物工程领域， 尤其是一种发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法。 背景技术 [0002]L‑谷氨酰胺(L ‑Glutamine,L ‑Gln)化学名为2,5 ‑二氨基‑5‑氧代戊酸， 分子式为 C5H10N2O3， 相对分子量为146.15， 结晶形状 为白色斜 方晶体或结晶性粉末状， 无臭， 有独特的 甜味。 易溶于水， 几乎不溶于乙醇， 氯仿等多种有机溶剂， 熔点为18 5℃， 等电点为5.65， 具有 热不稳定性， 遇热或酸碱易变性。 L ‑谷氨酰胺含有两个氨基， 一个是α ‑氨基， 一个是末端酰 胺基。 由于末端酰胺基易水解， 使L ‑谷氨酰胺不仅是生物体内嘧啶核苷酸、 嘌呤核苷酸、 核 酸和其他氨基酸 生物合成的必须原料之一， 还是 各器官间氮流动的重要载体。 [0003]近年来， 随着对L ‑谷氨酰胺的深入研究， L ‑谷氨酰胺被广泛应用于医药， 保健食 品， 饲料等领域。 作为一种具有潜力的新药， L ‑谷氨酰胺在临床上主要应用于治疗胃肠溃 疡， 缓解运动疲劳， 改善脑神经机能等方面。 随着对L ‑谷氨酰胺 生理作用以及应用范围的深 度研究， L ‑谷氨酰胺的需求量和生产量 都在不断增加， 且 药用需求量很大， 具有广阔的市场 前景。 L‑谷氨酰胺的工业生产方法主要有化学合 成法、 酶法和发酵法， 其中发酵法生产L ‑谷 氨酰胺是目前使用的主 要方法。 [0004]常见的L‑谷氨酰胺发酵培养基 添加大量的(NH4)2SO4， 导致NH4+浓度过高， 导致发酵 过程中菌体活力大大下降， 抑制L ‑谷氨酰胺 合成酶活性， 产酸效率下降， 副产 物谷氨酸生成 较多， 造成提取困难、 成本偏高等问题。 [0005]此外， 目前的发酵法生产L ‑谷氨酰胺， 由于发酵初期的培养基浓度过高， 产生对菌 体过高的渗透压， 使菌体生长缓慢,发酵周期延长。 发酵中后期， 发酵液中营养物质消 耗不 均， 营养物质不平衡， 可能缺少或积累某种营养， 导致菌体活力下降， 生长变慢过早衰亡， 产 酸效率低， 副产物也会随之增 加， 发酵周期 延长， 经济效益降低。 发明内容 [0006]本发明所要解决的技 术问题在于提供一种发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法。 [0007]为解决上述 技术问题， 本发明的技 术方案是： [0008]一种发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 具体步骤如下： [0009](1)将谷氨酸棒杆菌接种到斜面培养基活化， 接入摇瓶利用种子培养基进行一级 种子培养； [0010](2)一级种子 液接入发酵罐内进行二级种子培养以及发酵培养， 发酵过程中NH4+限 制发酵工艺、 全营养分割强迫发酵工艺。 [0011]优选的， 上述发酵生产L ‑谷氨酰胺的方法， 具体步骤如下： [0012](1)将谷氨酸 棒杆菌T‑6接种到斜 面培养基活化， 活化条件： 32℃， 12h； [0013](2)将斜面活化的菌种接入摇瓶进行一级种子培养， 34℃， pH7.0， 220rmp/min， 摇 床培养10h， 一级种子培养基体系100 mL； 一级种子液全部接入发酵罐内进行二级种子培养，说　明　书 1/6 页 3 CN 115505607 A 3