(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211178390.2 (22)申请日 2022.09.26 (71)申请人 南京林业大 学 地址 210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路 159号 (72)发明人 孙甜甜　张往祥　张一　范俊俊　 闫新阳　衡启蒙　 (74)专利代理 机构 南京智转慧移知识产权代理 有限公司 32649 专利代理师 邢少华 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) C12N 15/29(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/00(2018.01)C12N 1/20(2006.01) A01H 4/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种培育转抗旱基因杨树的方法 (57)摘要 本发明公开了一种培育转抗旱基因杨树的 方法， 属于植物基因工程技术领域。 本发明以优 良杨树品种为植物材料， 通过目的基因克隆、 载 体构建、 农杆菌侵染液的制备、 杨树叶片遗传转 化， 获得转基因抗旱杨树。 其中， 农杆菌侵染液中 含有根据树种的营养需求改进的AAM重悬培养 基， 杨树叶片遗传转化阶段培养基中含有TDZ和 Carb， 改进 的AAM重悬培养基可充分提高菌液活 性和转化效率， 加速芽的生长并提高出芽率和阳 性率， 与Carb的专适搭配可有效保证阳性率并抑 制农杆菌的过量生长， TD Z加速叶片细胞分化， 不 经愈伤组织可直接长出芽点， 缩短转化周 期， 实 现高效转化， 阳性率可高达62.5％， 可加速耐旱 型杨树的育种进程。 权利要求书2页 说明书9页 附图4页 CN 115491387 A 2022.12.20 CN 115491387 A 1.一种培 育转抗旱基因杨树的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)构建杨树耐干旱胁迫基因的植物 表达载体； 2)将所构建的杨树耐干旱胁迫基因的植物 表达载体转入农杆菌； 3)将含有杨树耐干旱胁迫基因的重组农杆菌用 改进的AAM重悬培养基进行重悬， 至 OD600为0.6‑0.9时， 加入2 00 μmol/LAS制成农杆菌侵染液； 所述改进的AA M重悬培养基的配方 为： 蔗糖68500mg/L+葡萄糖36000mg/L+KCl  3000mg/L+谷氨酰胺900mg/L+酸水解酪蛋白 500mg/L+MgSO4250mg/L+KH2PO4 185mg/L+精氨酸176mg/L+CaCl2·2H2O 150mg/L+肌醇 100mg/L+FeNaEDTA  36.7mg/L+VB1  10mg/L+MnSO4·H2O 7.58mg/L+甘氨酸7.5mg/L+H3BO3  3mg/L+ZnSO4·7H2O 2meg/L+烟酸1mg/L+VB6  1mgg/L+KI  0.8mgg/L+Na2MoO4·2H2O 0.25mg/ L+CoCl2·6H2O 0.025mg/L+CuSO4·5H2O 0.025mg/L； 4)选择生长状态良好的杨树组培苗， 取顶端幼嫩的叶片为植物材料， 去除主叶脉和叶 尖， 在叶脉 处进行创伤处理， 置于MS分化培养基中预培养24h； 将预培养的叶片取出， 置于侵 染液中侵染， 结束后将叶片取 出， 用滤纸吸干， 放回MS分化培 养基中， 在黑暗条件下倒置 3d； 5)将MS分化培养基中的叶片取出， 用无菌水冲洗后， 再用含有Carb的水冲洗， 滤纸吸干 后转入MS选择培 养基中培 养7d； 6)将MS选择培养基中的叶片转入MS筛选培养基中进行培养， 每10d更换一次筛选培养 基， 期间不经愈伤组织直接长出芽点， 待第3次更换培养基时， 将其转至装有转化植物生根 培养基的无菌组培瓶中， 获得转 抗旱基因杨树 苗。 2.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤1)中， 使用的 杨树耐干旱胁迫基因为PIP1； 1基因。 3.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤2)中， 使用的 农杆菌为GV3101农杆菌 。 4.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述MS 分化培养基的配方为： MS+NAA0.05mg/L+6 ‑BA0.5mg/L+TDZ0.01mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶 4.2g/L+AS  200 μmol/L， pH＝5.8 ‑6.0。 5.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤4)中， 选择生 长45‑55d、 状态良好的杨树组培苗。 6.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤4)中， 侵染时 间为15mi n， 侵染期间每隔3mi n摇晃1mi n。 7.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤5)中， 将MS分 化培养基中的叶片取 出， 用无菌水冲洗 5‑6次后， 再用含有40 0mg/L Carb的水冲洗 。 8.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤5)中， 所述MS 选择培养基配方为： MS+NAA  0.05mg/L+6 ‑BA 0.5mg/L+TDZ  0.01mg/L+蔗糖30g/L+植物 凝胶 4.2g/L+AS  200 μmol/L+Carb  400mg/L， pH＝5.8 ‑6.0； 培养 条件为： 在16h光照和8h黑暗条件 下培养7d。 9.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤6)中， 所述MS 筛选培养基配方为MS+NAA  0.05mg/L+6 ‑BA 0.5mg/L+TDZ  0.01mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶 4.2g/L+AS  200 μmol/L+Carb 400mg/L+Hyg  1.5mg/L， pH＝5.8 ‑6.0。 10.根据权利要求1所述的培育转抗旱基因杨树的方法， 其特征在于， 步骤6)中， 所述转权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115491387 A 2化植物生根培养基配方为1/2MS+NAA  0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+Hyg  1.5mg/L， pH＝ 5.8‑6.0。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115491387 A 3