(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211206946.4 (22)申请日 2022.09.30 (83)生物保 藏信息 CCTCC M20221407 202 2.09.09 CCTCC M20221406 2022.09.09 (71)申请人 甘肃农业大 学 地址 730000 甘肃省兰州市安宁区营门村1 号 (72)发明人 姚拓　柴加丽　李昌宁　刘晓婷　 李建宏　 (74)专利代理 机构 北京达友众邦知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11904 专利代理师 徐银辉 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01)C12N 1/02(2006.01) A01B 79/02(2006.01) A01G 7/06(2006.01) A01G 20/00(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种天然退化草地补播专用的微生物复合 接种剂及制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种天然退化草地补播专用 的微生物复合接种剂及其制备方法， 属于微生物 技术领域。 该微生物复合接种剂活性菌株包括醋 酸钙不动杆菌(Acinetobacter  calcoaceticus   HMAJ1)和假节杆菌(Pseudarthrobacter   sp.NCZ1)。 其制备方法为， 将2株单一菌株分别接 种于LB液体培养基， 于15℃、 180r ·min‑1条件下 培养48h后， 用无菌 水调节2菌株 单一培养 液OD600 值一致， 将醋酸钙不动杆菌和假节杆菌单一菌株 培养液以体积比3:7的比例接种至新的三角瓶 中， 得到天然退化草地补播专用的微生物复合接 种剂。 本发 明中微生物复合接种剂具有低温耐受 性， 适合在高寒草地使用， 操作便捷， 效益高， 可 直接喷洒施用。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115478032 A 2022.12.16 CN 115478032 A 1.一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂， 其特征在于： 所述的微生物复合 接种剂包括： 醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter  calcoaceticus  HMAJ1)和假节杆菌 (Pseudar throbacter  sp.NCZ1)的细菌 培养液； 所述的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter  calcoaceticus  HMAJ1)， 保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏时间为2022年09月09日， 保藏编号为： CCTCC  M20221406， 所述假节杆菌 (Pseudarthrobacter  sp.NCZ1)保藏于 中国典型培养物保藏中心， 保藏时间为2022年09月 09日， 保藏编号 为CCTCC M20221407。 2.本发明还公开了一种微 生物复合接种剂的制备 方法， 包括以下步骤： S1.选取菌株： 对从高寒草甸获得的植物根际促生菌进行筛选， 通过植酸钙有机磷培养 基与NBRIP无机磷培养基结合以及结合钼蓝比色法筛选优良溶磷菌， 选出2株植物 根际促生 菌， 随后通过培 养基对选出的2株植物根际促 生菌进行培 养； S2.制备单一菌悬 液： 分别将优良溶磷菌进行培 养， 得到单一菌悬 液； S3.制备微生物复合接种剂： 根据不同比例进行试验， 最终确定最佳菌剂配比， 得到所 述的微生物复合接种剂。 3.根据权利要求2所述的一种微生物复合接种剂的制备方法， 其特征在于： 步骤S1中， 选择出2的株植物根际促生菌， 分别为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter  calcoaceticus   HMAJ1)和假节杆菌(Pseudar throbacter  sp.NCZ1)。 4.根据权利要求2所述的一种微生物复合接种剂的制备方法， 其特征在于： 所述醋酸钙 不动杆菌(Acinetobacter  calcoaceticus  HMAJ1)和假节杆菌(Pseudarthrobacter   sp .NCZ1)的培养方法为： 通过平板划线法将醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter   calcoaceticus  HMAJ1)和假节杆菌(Pseudarthrobacter  sp.NCZ1)接种于LB液体培养基 中， 并放置 于15℃培 养箱培养7d， 即可长出新鲜菌落。 5.根据权利要求4所述的一种微生物复合接种剂的制备方法， 其特征在于： 平板划线法 是指把混杂 在一起的不同种微生物的不同个体或同一种的不同细胞， 通过接种环在培养基 表面做多次划线， 得到较多的独立分布的单个细胞， 经培养后即成单菌落。 其原理是将聚集 的菌种逐步稀释分散 到培养基的不同区域。 6.根据权利要求2所述的一种微生物复合接种剂的制备方法， 其特征在于： 步骤S2中， 所述单一菌悬液的制备方法为： 挑取2株单菌落分别接种于装有100mL  LB液体培养基的 300mL三角瓶， 于15℃、 180r ·min‑1摇床培养48h， 使得所述液体菌剂活菌浓度大于109cfu/ mL， 用无菌水调节 2株单一菌悬 液OD600值一致。 7.根据权利要求2所述的一种微生物复合接种剂的制备方法， 其特征在于： 所述步骤S3 中， 将醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter  calcoaceticus  HMAJ1)和假节杆菌 (Pseudarthrobacter  sp.NCZ1)单一菌悬液以体积比1:0、 3:7、 1:1、 7:3、 0:1的比例接种至 新的300mL三角瓶中保存备用， 得到5种微生物复合接种剂， 确定最佳菌剂配比为3:7， 得到 所述的微 生物复合接种剂。 8.权利要求1所述的天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂在高寒草甸天然退化 草地植被生长与土壤改良方面的应用。 9.权利要求1所述的天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂的应用方法为： 直接 喷洒使用， 使用量 为5.0kg‑6.0kg/亩。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478032 A 2一种天然退化草地补播专用的微生物复合 接种剂及制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 微生物技术领域， 特别涉及一种天然退化草地补播专用的微生物复合 接种剂及制备 方法。 背景技术 [0002]高寒草甸是我国重要的生态保护区， 该地区海拔高、 常年低温、 气候条件恶劣， 加 上不合理放牧等一系列人类活动， 使高寒草甸生态系统受到破坏。 草地作为发展畜牧业的 基础和重要的生态屏障， 其退化不仅改变了植物群落结构， 还影响土壤固碳、 水土保持等生 态服务功能。 因此， 加强 高寒地区草地生态的保护， 探寻促进草地植物生长和恢复的有效措 施势在必行。 [0003]近年来， 国内外研究表明， 植物根际促生菌(Plant  growth promoting   rhizobacteria,PGPR)是对植物生长具有促进作用的一大类有益菌， 能在植物根际定殖， 并 通过固氮、 溶磷、 分泌激素等功能来促进植物生长， 利用PGPR研制微生物菌肥或菌剂， 能够 修复土壤结构， 改善土壤养 分供应状况， 持续效果好且对环 境无污染， 为高寒地区牧草生长 和土壤修复提供新思路。 [0004]目前， 关于PGPR的研究主要集中于单一菌株， 但单一菌株往往效果不佳， 市场接受 度低， 已不能满足现代农业发展的需要。 微生物复合接种剂一般是指在培养液中混合两种 或两种以上的细菌， 充分发挥菌群的相互作用， 获得比单一接种剂促生能力更强、 更稳定的 微生物制剂。 微生物复合接种剂具有较强的适应性、 根际定殖能力和广谱效应。 因此， 开发 可为植物生长提供多种营养的微生物复合接种剂尤为重要， 利用植物根际促生菌研制微生 物复合接种剂对农业可持续发展具有重要意 义。 [0005]混播是指两种或两种以上牧草栽培在同一块土地上， 通常混播比单播可提高产草 量14％左右， 目前大量用于天然退化草地或人工建植草地。 目前最常见的混播是根据退化 高寒草甸免耕补播技术标准(地方标准DB63_T  1442‑2015)， 利用3种草种(垂穗披碱草 (Elymus nutans Griseb)、 中华羊茅(Festuca  sinensis)、 草地早熟禾(Po a pretensis)) 进行混播， 充分利用空间， 二氧化 碳和土壤水分及养分， 能延长利用时间， 提高牧草品质。 [0006]垂穗披碱草为禾本科披碱草属多年生草本植物， 具有抗性强、 营养品质高和适口 性好等特性， 是青藏高原等高寒牧区主要优质牧草品种之一。 垂穗披碱草对次生环境存在 高度适应性， 并且种子繁殖能力强， 是高寒地区天然退化草地补播和建植人工草地的首选 草种。 [0007]中华羊茅是禾本科羊茅属多年生草本植物， 是我国西北、 华北和青藏高原等地的 常见牧草， 具有 营养价值高、 再生性和抗逆性 强等优点。 此外， 中华 羊茅适口性较好， 为牲畜 所喜食， 这些都为中华羊茅能够成为高寒地区优良牧草的种质资源提供有利条件。 [0008]草地早熟禾属于禾本科早熟禾属的多年生冷季型禾草， 其广泛分布于欧亚大陆温 带和寒带地区， 适宜在湿度较大、 气候冷凉的地区生长。 草地早熟禾不但繁殖能力强且生长 年限长， 同时还具 备较强的抗寒及耐践踏能力， 是高寒草甸的优势牧草。说　明　书 1/5 页 3 CN 115478032 A 3