(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211227564.X (22)申请日 2022.10.09 (71)申请人 南京盛德生物科技研究院有限公司 地址 210044 江苏省南京市江北新区长芦 街道宁六路6 06号A栋583室 申请人 南京盛德百泰生物科技有限公司 (72)发明人 张莎莎　张强　叶凡　史鲁秋　 薛虹宇　苏桂珍　 其他发明人请求 不公开姓名　 (74)专利代理 机构 南京中擎科智知识产权代理 事务所(普通 合伙) 32549 专利代理师 黄智明 (51)Int.Cl. C12P 13/06(2006.01) C12N 1/20(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种高丝氨酸的发酵生产工艺 (57)摘要 本发明公开了一种高丝氨酸的发酵生产工 艺， 包括利用氨 基酸营养缺陷型基因工程菌来生 产高丝氨 酸的发酵生产方法。 在本发 明方法的发 酵过程中， 当菌浓达到OD600=50 ‑60时， 将溶氧控 制由30%降低为10%， 达到了提高发酵液中高丝氨 酸产量以及转 化率的目的。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115521954 A 2022.12.27 CN 115521954 A 1.一种高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特 征在于， 该 方法包括以下步骤： S1： 配制LB 摇瓶种子 培养基； S2： 将保藏于超低温冰箱的菌种融化后接种到上述培养基上， 进行摇瓶培养， 其中所用 菌种为已于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的氨 基酸营养缺陷型基因工程菌， 保藏 号为CGMCC No.20947； S3： 配制高丝氨酸发酵培 养基以及 补料培养基； S4： 将培养好的LB 摇瓶种子转接 到高丝氨酸发酵培 养基中进行发酵； S5： 发酵培养， 其中发酵条件为， 发酵初始调节溶氧30% ‑40%； OD600=30‑35时， 降温到30 ‑ 34℃， 加入诱导剂阿拉伯糖； 菌浓度达到OD600=50‑60时， 将溶氧控制降为10 ‑15%， 直到发酵 结束， 发酵 过程中， 利用氨水控制pH  6.5‑7.5， 监测残糖在1%以下； S6： 发酵结束条件， 补料培养基耗完后， 继续搅拌一段 时间， 直至溶氧 回升至40%或pH回 升至7.20以上， 发酵 结束。 2.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 步骤S1中， 所述LB培养 基制备方法如下： 配方为蛋白胨0.8 ‑1.2%， 酵母抽提粉0.4 ‑0.6%， 氯化钠0.4 ‑0.6%， pH为自 然pH， 配制5 00 ml体积， 5 00ml摇瓶， 每瓶分装10 0ml， 灭菌条件为121℃， 0.1mpa， 20mi n。 3.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 步骤S2中， 所述摇瓶培 养条件为： 20 0rpm， 30‑37℃， 4‑6h。 4.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 步骤S3中， 所述高丝氨 酸发酵培养基的配制方法为： 配制发酵罐培养基， 单独灭菌， 另外配制底糖溶液， 单独灭菌 后冷却， 再移入发酵 罐培养基中混合形成高丝氨酸发酵培 养基， 接种前用氨水调到pH7.0 。 5.如权利要求4所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 所述发酵罐培养基由如 下成分组成： 柠檬酸0.16 ‑0.18%， 磷酸二氢钾1.3 ‑1.5%， 磷酸氢二铵0.3 ‑0.5%， 七水硫酸镁 0.05‑0.07%， 微量无机盐10ml/L， 聚醚类消泡剂0.015 ‑0.02%， 赖氨酸0.08 ‑0.10%， 甲硫氨酸 0.03‑0.50%， 苏氨酸0.0 5‑0.07%， 灭菌条件为121℃， 0.1mpa， 20mi n。 6.如权利要求4所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 所述底糖为葡萄糖， 葡 萄糖溶液浓度为20 ‑22.5g/100ml， 灭菌条件为1 15℃， 0.1mpa， 20mi n。 7.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 步骤S3中， 所述高丝氨 酸发酵补料培 养基为60%葡萄糖， 灭菌在1 15℃， 0.1mpa， 20mi n。 8.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 步骤S5中， 培养工艺为： 初始流量为1vvm， 培养温度为35 ‑37℃， 搅拌， 氨水控制pH在6.5 ‑7.5， 同时控制残糖不超过 1%， 菌浓OD600达到30‑35时， 降温到30 ‑34℃， 加入诱导剂开始诱导； 菌浓OD600达到50‑60时， 溶氧控制在10 ‑15%， 直至发酵 结束。 9.如权利要求8所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 所述诱导剂为5%阿拉伯 糖溶液， 灭菌在1 15℃， 0.1mpa， 20mi n。 10.根据权利要求5所述的高丝氨酸的发酵生产工艺， 其特征在于， 所述微量无机盐组 成为： EDTA  840 mg/L， CoCl2•6H2O 250 mg/L， MnCl2•4H2O 1500 mg/L， CuCl2•2H2O 150 mg/ L， H3BO3 300 mg/L， Na2MoO4•2H2O 250 mg/L， Zn(CH3COO)2•2H2O 1300 mg/L， 柠檬酸铁 10 g/ L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521954 A 2一种高丝氨酸 的发酵生产工艺 技术领域 [0001]本发明涉及 微生物发酵生产技术领域， 具体为一种利用氨基酸营养缺陷型基因工 程菌生产高丝氨酸的发酵生产工艺。 背景技术 [0002]L‑高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸， 具有L ‑型‑α‑氨基酸的基本骨架， 并 且其γ‑羟基具有多样的化学活性， 因此在药物学、 生理学等方面有重要应用前景。 由于其 结构活性， L ‑高丝氨酸及其衍生物作为手性中间体， 在手性化学品合成领域也具有较好的 应用潜力。 L ‑高丝氨酸具有L‑草铵膦相同的分子骨架， 是制备L ‑草铵膦的理想手性前体。 草 铵膦属于膦酸类除草剂， 能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶， 从而干扰植物的 代谢， 使植物死亡。 草铵膦具有 杀草谱广、 低毒、 活性高和环境相容性好等特点， 其 发挥活性 作用的速度比百草枯慢而优于草甘膦。 目前化学合成的草铵膦均为DL外消旋体， 但仅L ‑草 铵膦具有除草作用， 而D型则几乎无活性。 若制成仅有L ‑草铵膦 （也称精 草铵膦） 的产品进 行 使用， 可使草铵膦的用量减少一半， 显著提高经济性， 降低使用成本， 减轻环境压力。 [0003]L‑高丝氨酸是少数还未实现规模化生产的氨基酸品种， 国内外文献报道以及专利 中， 发酵法生产L ‑高丝氨酸的产量均低于10 0g/L。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种新型的利用氨基酸营养缺陷型基因工程菌来生产高 丝氨酸的发酵生产方法。 在本发 明方法的发酵过程中， 当菌浓达到OD600=50‑60时， 将溶氧控 制由30%降低为10%， 达 到了提高发酵 液中高丝氨酸产量以及转 化率的目的。 [0005]为实现上述目的， 本发明提供如下技 术方案： 一种高丝氨酸的发酵生产工艺， 包括以下步骤： S1： 配制LB 摇瓶种子 培养基； S2： 将保藏于超低温冰箱的菌种融化后接种到上述培养基上， 进行摇瓶培养， 其中 所用菌种为已于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 的氨基酸营养缺陷型基因工程菌， 保藏 号为CGMCC No.20947； S3： 配制高丝氨酸发酵培 养基以及 补料培养基； S4： 将培养好的LB 摇瓶种子转接 到高丝氨酸发酵培 养基中进行发酵； S5： 发酵培养， 其中发酵条件为， 发酵初始调节溶氧30% ‑40%； OD600=30‑35时， 降温 到30‑34℃， 加入诱导剂阿拉伯糖； 菌浓度达到OD600=50‑60时， 将溶氧控制降为10 ‑15%， 直到 发酵结束， 发酵 过程中， 利用氨水控制pH  6.5‑7.5， 监测残糖在1%以下； S6： 发酵结束条件， 补料培养基耗完后， 继续搅拌一段时间， 直至溶氧回升至40%或 pH回升至7.20以上， 发酵 结束。 [0006]优选地， 步骤S1中， 所述LB培养基制备方法如下： 配方为蛋白胨0.8 ‑1.2%， 酵母抽 提粉0.4 ‑0.6%， 氯化钠0.4 ‑0.6%， pH为自然pH， 配制500  ml体积， 500ml摇瓶， 每瓶分装说　明　书 1/4 页 3 CN 115521954 A 3