(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211243216.1 (22)申请日 2022.10.11 (71)申请人 微康益生菌 （苏州） 股份有限公司 地址 215200 江苏省苏州市吴江经济技 术 开发区龙桥路10 33号 (72)发明人 方曙光　李腾宇　郭晓娟　汪欣　 朱建国　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 赵颖 (51)Int.Cl. C12N 1/04(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护 剂及冷冻方法和应用 (57)摘要 本发明提供一种提高保加利亚乳杆菌活性 的冷冻保护剂及冷冻方法和应用， 所述冷冻保护 剂按质量份计包括4 ‑20份甘油、 0.2 ‑5份L‑亚油 酸、 0.2‑5份α‑亚麻酸。 本发明创造性地将甘油、 L‑亚油酸和α ‑亚麻酸三者的组合应用于保加利 亚乳杆菌的冷冻保存中， 三者相辅相成， 在提高 和维持短期和长期的存活率和菌体活性方面具 有协同增效的作用。 本发明使用含有甘油、 L ‑亚 油酸和α ‑亚麻酸的冷冻保护剂， 实现了保加利 亚乳杆菌活菌数和菌活稳定性的大幅提升， 可以 为大规模生产提供 借鉴思路。 权利要求书1页 说明书12页 CN 115478017 A 2022.12.16 CN 115478017 A 1.一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂， 其特征在于， 所述冷冻保护剂按质量 份计包括4‑20份甘油、 0.2 ‑5份L‑亚油酸、 0.2 ‑5份α‑亚麻酸。 2.如权利要求1所述的冷冻保护剂， 其特 征在于， 所述冷冻保护剂还 包括抗冻蛋白。 3.如权利要求1或2所述的冷冻保护剂， 其特征在于， 所述冷冻保护剂按质量份计还包 括0.02‑2份抗冻蛋白。 4.如权利要求1 ‑3中任一项所述的冷冻保护剂在保加利亚乳杆菌冷冻保存中的应用。 5.一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻方法， 其特征在于， 所述冷冻方法包括将保加 利亚乳杆菌液与如权利要求1 ‑3中任一项所述的冷冻保护剂混匀， 进行降温再冷冻。 6.如权利要求5所述的冷冻方法， 其特征在于， 所述保加利亚乳杆菌菌液由如下方法制 得： 将保加利亚乳杆菌 菌种接种 、 培养， 得所述保加利亚乳杆菌 菌液。 7.如权利要求6所述的冷冻方法， 其特征在于， 所述保加利亚乳杆菌菌液培养用培养基 的原料包括甘 氨酸、 山梨 糖醇、 甜菜碱和氯化钠。 8.如权利要求7所述的冷冻方法， 其特征在于， 所述培养基的原料以质量份数包括1 ‑8 份甘氨酸、 3‑40份山梨 糖醇、 1‑14份甜菜碱和3 0‑60份氯化钠。 9.如权利要求5 ‑8中任一项所述的冷冻方法， 其特征在于， 所述保加利亚乳杆菌菌液与 冷冻保护剂的质量比为(0.5 ‑10):1； 优选地， 所述培 养的温度为3 0‑40℃， 所述培 养的时间为6 ‑12h。 10.如权利要求5 ‑9中任一项所述的冷冻方法， 其特征在于， 所述降温的降温速度为2 ‑ 10℃/min， 降至‑5℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478017 A 2一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂及 冷冻方法和 应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物 冷冻保藏技术领域， 具体涉及 一种提高保加利亚乳杆菌活性的 冷冻保护剂及冷冻方法和应用。 背景技术 [0002]保加利亚乳杆菌为革兰阳性、 厌氧或兼性厌氧及无芽孢杆菌， 广泛应用于乳制品 发酵食品中。 保加利 亚乳杆菌菌体较一般的乳酸菌长， 大小为(0.6 ‑1)×(2‑20)μm， 因其菌 体大在冷冻保存过程中容易细胞膜的损伤， 造成其抗冻性差， 冷冻稳定性差， 进而影响种子 液的活性， 生产批次稳定性。 目前保加利亚乳杆菌的保存方法主要采用甘油法， 该保存方法 成熟， 但是在冷冻储存过程中， 保加利亚乳杆菌细胞衰亡快， 不易长期保存， 对产业化生产 影响较大。 亟需探索出一种能够延 长保加利亚乳杆菌甘油管保存时间的方法。 目前， 冷冻对 保加利亚乳杆菌菌体造成损伤的机制尚不完全清楚。 目前已经提出了两种取决于冷却速率 的损伤机制， 其一是在低冷冻速率下， 细胞损伤主要 是由对细胞的渗透压力引起的(所谓的 “溶液效应 ”)。 其二是冷冻过程中细胞外冰晶的形成， 在介质中诱导高溶质浓度， 从而破坏 细胞膜。 [0003]专利文件CN111107877A公开了一种用于培养和保存细 菌的方法和组合物， 其中与 通过除主题方法以外的手段保存/储存的细菌相比， 培养和保存的细菌展现出改进的活力/ 生长。 更具体地， 该发 明公开了用于在冷冻保存后改进细菌活力的方法和组合物。 所述方法 包括： a)将第一细菌物种与至少一种第二细菌物种组合以产生细菌混合物， 其中所述第一 细菌物种是氨基酸球菌属物种或氨基酸球菌科的成员， 其中所述第一细菌物种以足以对所 述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述细菌混合物中， 并且其中氨基酸球 菌科物种的成员是运动琥珀 酸螺菌； b)培养所述细菌混合物以产生培养的细菌混合物， 其 中所述培养持续足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述 冷冻保护的时间段； 和c)冷冻保存所述培养的细菌混合物以产生冷冻保存的细菌培养物； 其中在细菌增殖测定中， 所述冷冻保存的细菌培养物在重构后， 相对于包含所述至少一种 第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖， 展 现出所述至少一种第二细菌物种的至少10 ×增加的细菌增殖。 [0004]保加利亚乳杆菌菌体较大， 在冷冻保存过程中易出现细胞膜损伤， 造成其抗冻性 差， 稳定性差。 现有技术中保加利亚乳杆菌的保存方法主要采用的甘油法， 保加利亚乳杆菌 细胞衰亡快， 不易长期保存， 对产业化生产影响较大， 因此， 探索优化提高保加利亚乳杆菌 低温冷冻的方法是非常有意 义的。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种冷冻保护剂及冷冻方法和应 用， 具体提供一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂及冷冻方法和应用。说　明　书 1/12 页 3 CN 115478017 A 3