(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211244483.0 (22)申请日 2022.10.12 (71)申请人 西安交通大 学 地址 710049 陕西省西安市碑林区咸宁西 路28号 (72)发明人 金鹏康　白雪　许路　石烜　金鑫　 (74)专利代理 机构 西安智大知识产权代理事务 所 61215 专利代理师 段俊涛 (51)Int.Cl. B09C 1/10(2006.01) C12N 11/14(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12R 1/785(2006.01) (54)发明名称 一种含油污泥制备生物炭固定化真菌-细菌 联合菌剂降解油泥 石油烃的方法 (57)摘要 一种含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌 联合菌剂降解油泥石油烃的方法， 取所要降解的 含油污泥制得含油污泥基生物炭； 筛选石油烃降 解细菌和真菌， 并经单因子实验确定最佳复配比 例； 将含油污泥基生物炭灭菌后， 与LB培养基混 合， 密封， 灭菌； 按最佳复配比例接种真菌、 石油 烃降解细菌， 培养， 过滤， 冲洗， 得到生物炭 ‑微生 物复合材料， 即生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌 剂。 在生物炭固定化微生物对石油烃的降解过程 中， 一方面使吸附到表面的微生物对污染物进行 生物降解； 另一方面减 轻了污染物对土著微生物 的毒害作用。 此外， 引入菌丝发达真菌， 利用真菌 菌丝的脉管作用增强细菌及污染物的传递， 降低 污染物被摄取难度， 进一步提高石油烃降解效 果。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 115446108 A 2022.12.09 CN 115446108 A 1.一种含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油烃的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤(1)， 含油污泥生物炭制备 取所要降解的含油污泥烘干， 烧制， 制得含油污泥基生物炭； 步骤(2)， 石油烃降解细菌的筛 选 步骤(3)， 真菌 筛选及复配 选择真菌， 与筛 选出的石油烃降解细菌经 单因子实验确定最佳复配比例； 步骤(4)， 固定化联合菌剂制备 将所述含油污泥基生物炭灭菌后， 与LB培养基混合， 密封， 灭菌； 按最佳复配比例接种 所述真菌、 所述石油烃降解细菌， 于摇床 内培养， 将得到的混合物过滤， 并冲洗去除游离的 细胞， 得到生物炭 ‑微生物复合材 料， 即所述 生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂。 2.根据权利要求1所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)， 将烘干的含油污泥过40目筛， 取筛下污泥放入 管式炉 内， 在500±10℃、 氮吹的条件下烧制2 ±0.5个小时， 得到含油污泥基生物炭。 3.根据权利要求1所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)采用基于扩散 室系统的含油污泥功能微生物原 位培养 筛选方法筛 选石油烃降解细菌， 过程如下： 步骤(21)， 构建扩散室系统 扩散室系统由多个扩散室组成， 每个扩散室由金属环、 PC顶膜和 PC底膜构成， 金属环带 有中央通孔， P C顶膜和P C底膜分别紧扣 在其两端； PC底膜封闭后， 向所述中央通孔注入固体 培养物， 之后封闭P C顶膜； 将 封闭后的扩散 室插入土壤基质中， 底部嵌入， 顶部露出； 常温条 件下恒温培养； 其中， 固体培养物由无菌琼脂、 土著菌悬液及石油混合制成； 土壤基质由含 油污泥滴入灭菌纯 水制成； 步骤(22)， 富集 培养若干天后取出各个扩散室， 去掉PC底膜， 在生理盐水中震荡形成菌悬液， 然后与无 菌琼脂及 石油混合， 制成新的固体培养物， 按步骤(21)方法注入新的扩散室， 并置于相同的 土壤基质中， 继续常温条件下恒温培 养； 将步骤(2 2)循环数次； 步骤(23)， 菌株分离 对最后一 次洗脱出的菌悬液进行梯度稀释， 将连续稀释的上清液涂布到含有石油的LB 琼脂平板上， 能够以石油烃为碳源生长的微生物 聚集生长出肉眼可见菌斑， 采用无菌棒挑 取分离出石油烃降解菌 。 4.根据权利要求1所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特 征在于， 所述 步骤(3)， 选择的真菌为毛霉菌 。 5.根据权利要求4所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特征在于， 所述毛霉菌为菌丝发达的高大毛霉菌， 菌株保存号： CGMCC   NO.19025 。 6.根据权利要求1或4或5所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油 泥石油烃的方法， 其特征在于， 所述单 因子实验方法如下： 取6个锥形瓶， 添加等量无机盐培权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115446108 A 2养基， 添加0.1％石油储备液， 分别以真菌： 细菌的体积比为0.2:1、 0.5:1、 1:1、 1.5:1、 2:1接 种于各锥形瓶， 并设不接种真菌为对照， 于25 ±3℃恒温摇床培养7 ±1d， 测定石油降解率， 最高者即为 最佳复配比例。 7.根据权利要求6所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特征在于， 所述无机盐培养基由以下步骤配制而成： 取K2HPO41±0.2g， KH2PO41 ±0.2g， NaCl0.5 ±0.1g， NH4Cl1±0.2g， CaCl20.015±0.002g， M gSO4·7H2O0.2±0.05g， 微 量元素液1 ±0.1mL， 溶于1 ±0.1L去离子水； 所述步骤(4)， LB培养基由以下步骤配制而成： 取酵母粉5 ±0.5g， 蛋白胨10 ±1g、 NaCl10 ±1g， 溶于1 ±0.1L去离子水； 摇床内培养的条件 为： 30±5℃， 80±10rpm培养48±2h。 8.根据权利要求1所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)， 接种得到的菌悬液 中含有的菌落总数为1 ×108CFU· mL‑1， 含油污泥基生物炭与菌悬 液比例为1:20(w/v)。 9.根据权利要求1所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)， 将得到的生物炭 ‑微生物复合材料在4℃储存， 至复合 材料表面形成生物 膜后， 取出施加于含油污泥中。 10.根据权利要求1所述含油污泥制备生物炭固定化真菌 ‑细菌联合菌剂降解油泥石油 烃的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)， 以质量计， 固定化真菌 ‑细菌联合菌剂的施加量为 5％。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115446108 A 3