(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211258879.0 (22)申请日 2022.10.14 (71)申请人 安徽大学 地址 230601 安徽省合肥市经济技 术开发 区九龙路1 11号 (72)发明人 吴庆喜　王静　刘彩霞　吴迎超　 (74)专利代理 机构 安徽省合肥新 安专利代理有 限责任公司 34101 专利代理师 卢敏 (51)Int.Cl. C12N 9/04(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12P 33/02(2006.01) C12R 1/64(2006.01) C12R 1/145(2006.01)C12R 1/19(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种7α-羟基类固醇脱氢酶的制备方法及 其催化转化应用 (57)摘要 本发明公开了一种7α ‑羟基类固醇脱氢酶 的制备方法及其催化转化应用， 是利用野生菌通 过超声破碎制得7α ‑羟基类固醇脱氢酶， 并利用 该酶催化CDCA或者CDCA包 合物转化为7K ‑LCA。 本 发明的转化方法可以大大缩短转化时间、 提高转 化效率， 且 该步反应是鹅去 氧胆酸到熊去氧胆酸 两步酶法转化中的关键步骤， 为酶法两步转化熊 去氧胆酸奠定 了基础。 权利要求书1页 说明书6页 附图7页 CN 115386557 A 2022.11.25 CN 115386557 A 1.一种7α ‑羟基类固醇脱氢酶的制备方法， 其特征在于： 通过对含7α ‑羟基类固醇脱氢 酶的菌种进行超声破碎， 从而获得。 2.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)配制pH  7.0‑11.0的磷酸盐缓冲液； (2)配制600mL营养肉汤培养基， 接种含7α ‑羟基类固醇脱氢酶的菌种后， 置于30℃、 120rpm的摇床中培 养； (3)将步骤(2)中生长至对数期的菌液在0 ‑20℃、 9000 ‑12000rpm转速下离心5 ‑15min， 去除上清液， 将菌体用无菌水进行重悬、 离心洗涤 2‑3次； (4)将步骤(3)所得菌体用pH  7.0‑11.0的磷酸盐缓冲液重悬， 0 ‑4℃冰浴下在超声波细 胞破碎仪中进行超声破碎， 获得破碎液； (5)将步骤(4)所得破碎液在0 ‑20℃、 9000 ‑12000rpm转速下离心3 ‑10min， 所得上清液 即为7α‑羟基类固醇脱氢酶的粗酶液。 3.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于： 所述含7α ‑羟基类固醇脱氢酶的菌 种为瘤胃球菌、 嗜麦芽黄单胞菌、 梭状芽胞杆菌、 大肠杆菌、 铜 绿假单胞菌和双 歧杆菌中的 至少一种。 4.根据权利 要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤(4)中， 超声波细胞破碎仪工作2s 停2s， 共超声35‑60min， 直至菌液澄清。 5.根据权利 要求2所述的制备方法， 其特征在于： 所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/ L。 6.一种权利要求1～5 中任意一项所述制备方法所制得的7α ‑羟基类固醇脱氢酶的催化 转化应用， 其特 征在于： 用于催化CDCA或者CDCA包合物转 化为7‑酮石胆酸7 K‑LCA。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 在所述7α ‑羟基类固醇脱氢酶的粗酶液中 加入甲醇， 然后投入作为底物的CDCA或者CDCA包合物， 再加入烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸NAD+， 获得转化体系， 其中： CDCA在转化体系中的浓度为0.5mg/mL ‑3mg/mL， 甲醇在转化体系中的 体积浓度为10 ‑35vol％， NAD+在转化体系中的浓度为0.5 ‑2.5mg/mL； 将转化体系置于2 5‑55 ℃、 120rpm摇床中进行转 化， 转化时间10 ‑60h， 转化结束后水浴煮沸终止反应。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386557 A 2一种7α‑羟基类固醇脱 氢酶的制备方 法及其催化转化应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种7α ‑羟基类固醇脱氢酶的制备方法及其催化转化应用， 属于生物 催化转化领域。 背景技术 [0002]根据来源可以将胆汁酸分为两大类： 初级胆汁酸和次级胆汁酸。 在肝脏中， 直接以 胆固醇合成 的胆汁酸如鹅去氧胆酸(CDCA)、 牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、 胆酸(CA)、 牛磺胆酸 (TCA)等均属 于初级胆汁酸。 初级胆汁酸分泌到肠道， 由肠道细菌酶催化， 经过7α脱羟作用 形成次级胆汁酸， 包括熊去氧胆酸(UDCA)、 石胆酸(LCA)、 牛磺石胆酸(TLCA)等。 哺乳动物肠 道微生物可调节次级胆汁酸的合成， 进一步影响机体内的信号传递， 从而满足正常机体运 作。 [0003]熊去氧胆酸(UrsodeoxycholicAcid)简称UD CA， 商品名优思弗， 临床上用于治疗胆 结石、 脂肪肝及各型肝炎等常见疾病， 是美国FDA唯一批准用于原发性胆汁性肝硬化 (Primary biliary cirrhosi s， PBC)的药物。 UDCA一般来源于熊胆或使用化学方法合成。 基 于动物保护， 活熊取胆来源受到严格限制， 环境友好型生物转 化UDCA的需求愈来愈迫切。 [0004]在鹅去氧胆酸(CDCA)经7酮 ‑石胆酸(7K ‑LCA)再到熊去氧胆酸(UDCA)的生物转化 途径中， 羟基类固醇脱氢酶起到十分关键的作用。 7α ‑羟基类固醇脱氢酶(7α ‑HSDH， 分子量 为26kDa)和7β ‑羟基类固醇脱氢酶(7β ‑HSDH， 分子量为30kDa)是一种氧化/还原型辅酶 (NADH/NADPH)依赖性短链 脱氢酶， 在NAD+/NADP+的作用下， CDCA的7位羟基氧化成酮羰基， 形 成7K‑LCA； 在NADH/NADPH的作用下， 7位酮羰基还原成β ‑羟基， 形成UDCA， 实现UDCA的两步转 化。 本发明主要针对于环境友好型酶法转化7K ‑LCA进行探 究， 相较于全细胞转化等其他方 法， 酶法转化在提高了转化率的同时可以大大缩短转化时间， 进一步为UDCA的高效转化及 利用提供 可能。 发明内容 [0005]基于上述现有技术所存在的不足之处， 本发明提供一种7α ‑羟基类固醇脱氢酶(7 α‑HSDH)的制备方法， 所得7α ‑HSDH可在保证转化率的同时短时间内催化CDCA或者CDCA包合 物转化为7‑酮石胆酸7 K‑LCA， 实现了 两步酶法转 化UDCA中的关键一 步。 [0006]本发明为实现目的， 采用如下技 术方案： [0007]一种7α‑羟基类固醇脱氢酶的制备方法， 其特点在于： 通过对含7α ‑羟基类固醇脱 氢酶的菌种进行超声破碎， 从而获得， 具体包括如下步骤： [0008](1)配制pH  7.0‑11.0的磷酸盐缓冲液； [0009](2)配制600mL营养肉汤培养基， 接种含7α ‑羟基类固醇脱氢酶的菌种后， 置于30 ℃、 120rpm的摇床中培 养； [0010](3)将步骤( 2)中生长至对数期的菌液在0 ‑20℃、 9000 ‑12000rpm转速下离心5 ‑ 15min， 去除上清液， 将菌体用无菌水进行重悬、 离心洗涤 2‑3次；说　明　书 1/6 页 3 CN 115386557 A 3