(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211273269.8 (22)申请日 2022.10.18 (71)申请人 湖南祥民制药有限公司 地址 415200 湖南省常德市临澧经济开发 区安福工业园 (72)发明人 吴新明　蒋奇　 (74)专利代理 机构 北京权智天下知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11638 专利代理师 罗宇智 (51)Int.Cl. C12P 7/66(2006.01) C12P 9/00(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C07F 9/10(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方 法 (57)摘要 本发明属于菌体磷脂提取领域， 具体公开了 一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法， 包括以下步骤： 1)母液培养、 2)种子 罐培养、 3)发 酵罐培养、 4)发酵液离心、 5)高压匀浆、 6)菌体破 碎液离心、 7)真 空冷冻干燥、 8)亚临界萃取、 9)丙 酮萃取、 10)旋转蒸发； 本发明通过调整培养基成 分和优化培养工艺， 能够实现对根癌农杆菌菌体 的高密度培养， 获得大量菌体， 发酵液中， 辅酶 Q10含量可达5.1g/L发酵液,磷脂含量可达 13.5g/L发酵液,并且本方法还公开了可以高效 的从辅酶Q10发酵粉中提取出高纯度的磷脂的分 离提纯方法， 变废为宝， 经济效益好， 并且步骤简 单温和， 对设备要求低， 绿 色环保。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 115449530 A 2022.12.09 CN 115449530 A 1.一种从辅酶Q10发酵粉中 高效提纯磷脂的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)母液培养： 将根癌农杆菌稀释至1 ‑5x103个/mL后接种0.1 ‑1mL至斜面培养基上， 将斜 面培养基置于温度为30 ‑34℃， 相对湿度为45％ ‑55％的培养箱中培养2 ‑6d后， 挑取1个菌落 接种于母瓶培养基中， 将母瓶培养基置于30 ‑34℃， 相对湿度为45％ ‑55％， 转速为220 ‑ 350rpm的摇床中培 养24‑48h， 得到母液菌种； 2)种子罐培养： 将母液菌种按1 ‑3‰的接种量接种至种子罐中的种子罐培养基中， 在 30‑35℃， 罐压0.03 ‑0.05MPa， 通气比0.3 ‑0.6， 搅拌转速2 00‑250rpm， 培养24 ‑48h， 得到葡萄 糖残量0.5 ‑1.0g/L， 菌体形状均一， 无菌良好的一级种子液； 3)发酵罐培养： 将种子液按5 ‑10％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基， 在35 ‑38 ℃， 罐压0.03‑0.06MPa， 通气比0.6 ‑0.8， 搅拌转速1 10‑140rpm， 培 养24‑36h； 4)发酵液离心： 将发酵 液8000‑15000rpm低温离心10 ‑20min， 取沉淀获得菌体； 5)高压匀浆： 将菌体沉淀按固液比质量1:10 ‑20的比例加入菌体裂解液溶解后， 加入高 压匀浆机进行菌体破碎， 收集菌体破碎液； 6)菌体破碎液离心： 将菌体破碎液120 00‑15000rpm低温离心， 弃去沉淀， 取 上清； 7)真空冷冻干燥： 对上清进行真空冷冻干燥， 真空度小于133pa， 温度低于 ‑50℃， 得到 干燥的发酵粉； 8)亚临界萃取： 取干燥的发酵粉投入萃取罐中， 将萃取罐内抽至真空状态后， 加入萃取 剂进行亚临界萃取， 萃取结束后， 将萃取所得含脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐倒入脱 溶罐中， 进行加热减压蒸发， 待溶剂脱除完毕， 得粗 提物； 9)丙酮萃取： 将粗提物加入到质量分数50 ‑60％丙酮溶液中， 4 ‑10℃冷却结晶4 ‑8h， 随 后0.45 μm过 滤， 得滤饼； 10)旋转蒸发： 将滤饼用去离 子水冲洗后旋转蒸发水分和有机溶剂， 得到磷脂 。 2.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法， 其特征在于， 所述步骤1)斜面培养基的组成如下： 蛋 白胨8g/L、 酵母浸膏5g/L、 氯化钠3g/L、 琼脂18g/L, pH值7.2、 阿特拉津0.0 5g/L， pH值7.4。 3.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法， 其特征在于， 所述步骤2)种子罐培养基的组成如下： 蔗糖35g/L、 玉米浆15g/L、 酵母浸膏10g/L、 NaCl  3g/ L,阿特拉津0.0 3g/L， pH值7.4。 4.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法， 其特征在于， 所述步骤3)发酵培养基的组成如下： 蔗糖45g/L、 玉米浆30g/L、 酵母浸膏10g/L、 NaCl  3g/L、 磷酸二氢钠0.5g/L、 磷酸氢二钠0.5g/L、 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.02g/L。 5.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法， 其特征在于， 所述步骤5)高压匀浆中， 工作压力120 0‑1500Bar,匀浆3 ‑6次。 6.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法， 其特征在于， 所述步骤5)中的菌体裂解液组成如下： 50mmol/L  Tris‑Cl pH6.8,100mmol/L  DTT,2％SDS, 0.1％溴酚蓝,10％甘油。 7.根据权利要求1所述的一种从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷脂的方法， 其特征在于， 所述步骤8)亚临界萃取中， 所述真空状态指压力小于13 3Pa， 所述萃取剂为乙醇。 8.如权利要求1 ‑7任一项所述的方法制备的磷脂 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115449530 A 2一种从辅酶Q10发酵 粉中高效提纯磷脂的方 法 技术领域 [0001]本发明属于菌体磷脂提取领域， 具体公开了一种 从辅酶Q10发酵粉中高效提纯磷 脂的方法。 背景技术 [0002]辅酶Q10是呼吸链中NADH脱氢酶、 琥珀酸脱氢酶和BC复合物之间的脂溶性电子载 体， 是ATP生成要素， 在细胞线粒体内呼吸链质子转移及电子传递中起重要作用， 是细胞呼 吸和细胞代谢的激活剂， 也是重要的抗氧化剂和非特异 性免疫增强剂 。 由于辅酶Q 10能增强 体能和精力、 保护心血管、 减少降脂药的副作用、 保护皮肤等功能， 因此对于提高免疫力、 延 缓衰老、 保健美容等方面也具有重要的应用价值。 目前， 辅酶Q10的制备方法主要有3种： 提 取分离法、 化学合成法、 生物合成法。 提取分离法提取分离法主要从动物肝脏、 心肌等和植 物含油种籽或嫩芽、 嫩叶中提取。 提取法是现代 生物工程中较为传统的生产方法， 它的生产 成本较高， 原料也 不易得到。 [0003]化学合成法辅酶Q10化学合成法可分为全化学合成法和半化学合成法2种。 全化学 合成法是指不以来自烟草等的茄尼醇为原料， 完全通过化学方法获得辅酶Q10侧链的合成 方法。 该方法原料价廉易得， 产 物区域选择性和立体选择性高， 但是侧链的构建需要多次耦 合， 总收率低， 难以实现工业化。 半化学合成法主要有侧链直接引入法和侧链延长法， 该方 法均需要以天然茄尼醇为关键原料合成辅酶Q 10， 由于精品及纯品茄尼醇的价格十 分昂贵， 造成化学合成辅酶Q10成本高昂， 同时具有合成步骤多、 副产品多、 手性物质分离困难等缺 点， 因此， 化学合成法在工业 生产中受到一定限制。 [0004]生物合成法生物合成法是利用微生物细胞、 植物细胞或动物细胞的生命活动而获 得人们所需物质的技术过程。 目前， 辅酶Q 10的生物 合成方法包括利用植物细胞培和微生物 细胞发酵两种 方式。 植物细胞培养主要是以烟草组织为材料， 通过愈伤诱导、 悬浮培养， 产 生生长速度快、 辅酶Q10含量高的烟草悬浮培养细胞。 1977年， 日本首次实现了微生物发酵 法工业化生产辅酶Q10。 应用于产辅酶Q10的主要菌种有光合细菌、 土壤杆菌、 红假胞菌、 裂 殖酵母等。 该方法具有原料廉价丰富， 产物分离过程相对简单， 不存在手性问题等优点， 目 前也有很多利用发酵法生产辅酶Q10的报道， 如CN200910093966.3一种发酵生产辅酶Q10的 方法， 包括以下步骤： 先将根癌土壤杆菌以5～15％的接种 量， 进行高密度好氧发酵60～84 小时， 发酵培养基组分为葡萄糖12～20％， 硫酸铵0.5～1.5％， 磷酸二氢钾0.1～0.5％， 硫 酸镁0.01～0.05％， 玉米浆0.5～2.5％， 磷酸氢二铵0.2～1％， pH6～7.5， 发酵温度为28～ 31℃； 然后将获得的发酵液进 行分离， 得分离菌体； 最后将所述分离菌体重悬后， 经回流、 萃 取， 得辅酶Q10。 其工艺简单， 发酵液菌体浓度低， 生产成本低， 适用于大规模生产。 还有， CN202011030403.2一种辅酶Q10的发酵方法， 方法中分周期控制铵离子浓度， 发酵培养基中 添加赖氨酸盐并且在发酵过程中再次补入赖氨酸盐， 发酵过程中补加 一次硫酸钠。 该发酵 控制工艺使辅酶Q10产生菌的生长和代谢能力明显增强， 菌体量明显增加， 辅酶Q10发酵单 位增长快， 辅酶Q10放罐效价达到4000 mg/L以上， 发酵周期明显延长， 菌体容易过滤收集， 辅说　明　书 1/8 页 3 CN 115449530 A 3