(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211275016.4 (22)申请日 2022.10.18 (71)申请人 茅台学院 地址 564500 贵州省仁怀市鲁班大道 (72)发明人 王新叶　赵亮　刘苹香　张浪梅　 马元元　 (74)专利代理 机构 重庆强大凯创专利代理事务 所(普通合伙) 50217 专利代理师 金国强 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) A01G 22/20(2018.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/05(2006.01)C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方 法及其应用 (57)摘要 本申请公开了高粱内生菌应用技术领域的 一种红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法， 包 括以下步骤： S1、 红缨子糯高粱根处理； S2、 母液 提取： 使用无菌水冲洗无菌研钵， 碎根和冲洗液 转移到无菌三角瓶中， 无菌三角瓶中的液体作为 母液； S3、 母液稀释： 吸取一定量的母液稀释至 10‑1的溶液A， 吸取一定量的溶液A稀释至10 ‑2的 溶液B,吸取一定量的溶液B稀释至10 ‑3的溶液C； S4、 细菌培养： 分别吸取到一定量的溶液A、 溶液B 和溶液C涂抹在平板上， 然后放入培养箱进行倒 置培养； S5、 菌落保藏： 平板 上挑选单菌落进行纯 化； S6、 菌落筛选： 菌株进行解钾、 固氮、 产铁载体 能力和产植物激素IA A活性分析。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 115491308 A 2022.12.20 CN 115491308 A 1.一种红缨子糯高粱根内生 促生菌的筛 选方法， 其特 征在于， 包括以下步骤， S1、 红缨子糯高粱根处 理： 高粱根消毒后在无菌研钵中研碎； S2、 母液提取： 使用无菌水冲洗无菌研钵， 碎根和冲洗液转移到无菌三角瓶中， 无菌三 角瓶中的液体作为母液； S3、 母液稀释： 吸取一定量的母液稀释至10 ‑1的溶液A， 吸取一定量的溶液A稀释至10 ‑2 的溶液B,吸取一定量的溶 液B稀释至10 ‑3的溶液C； S4、 细菌培养： 分别吸取到一定量的溶液A、 溶液B和溶液C涂抹在平板上， 然后放入培养 箱进行倒置 培养； S5、 菌落保藏： 平板上挑选单菌落进行纯化， 使用LB固体培养基将菌株培养2～3d后， 养 好菌株的LB培 养基中加入甘油溶 液， 刮取菌株装 入甘油管保存； S6、 菌落分子生物学： 对菌株进行DNA提取、 DNA片段扩增 和序列比对； S7、 菌落筛选： 菌株进行解钾、 固氮、 溶磷、 产铁载体能力、 产 植物激素IAA活性的分析和 植物生长实验， 筛选出具有解钾能力、 固氮能力、 产铁载体能力、 产植物激素IAA活性高的一 种或者多种菌株。 2.根据权利要求1所述的红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法， 其特征在于， 所述高 粱根消毒时用70％乙醇润洗2min， 无菌水冲洗3遍， 50％次氯酸钠润洗5min， 无菌水冲洗3 遍， 70％乙醇润洗2mi n， 无菌水冲洗 3遍。 3.根据权利要求2所述的红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法， 其特征在于， 所述S4 中溶液A、 溶液B和溶液C分别涂抹2 ～3个平板 。 4.根据权利要求3所述的红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法， 其特征在于， 所述S6 中解钾分析采用解钾培养基将菌株培养3～5天、 固氮分析采用阿须贝培养基将菌株培养3 ～5天、 溶磷分析采用无机磷培养基中， 培养3 ‑5天后， 产铁载体能力分析采用CAS培养基培 养3～5天。 5.根据权利要求4所述的红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法， 其特征在于， 所述植 物生长实验 包括种子发芽实验和植物盆栽实验。 6.根据权利要求5所述的红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法， 其特征在于， 甘油溶 液的浓度为3 0％。 7.根据权利要求6所述的红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法， 其特征在于， 产植物 激素IAA活性使用R2 A培养基、 Sal kowski比色液、 白瓷版、 分光 光度计测定 。 8.根据权利要求1～7任一项所述的红缨子糯高粱根内生促生菌在促进高粱生长的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115491308 A 2一种红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及高粱内生菌应用技术领域， 具体涉及 一种红缨子糯高粱根内生促生菌 的筛选方法及其应用。 背景技术 [0002]植物内生菌通常指在植物组织中生活某一阶段或所有阶段且不会改变植物的表 面特性， 不会对寄主植物造成明显疾病症状的微生物。 它 是植物微生物的重要组成部分之 一， 包括内生细菌、 内生真菌和内生放线菌， 主要存在于植物的根、 茎、 叶、 花、 果 实、 种子中， 与宿主植物形成共生活寄生的关系， 分布范围比较广， 种类 较多。 [0003]目前酱香型白酒是最受欢迎 的白酒之一， 主要产地是贵州， 主要酿酒原料是红缨 子糯高粱。 但 贵州气候特殊气候(多雨少晴)， 地形主要以丘陵、 山地为主， 耕地面积少， 在这 样的背景条件下， 如何利用有限的耕地面积生产出足够多且质量上乘的红缨子糯高粱， 以 便为各酒企提供充足的酿酒原料。 为此， 本申请以以茅台镇酱香白酒酿酒原料红缨子糯高 粱根为材料， 从 中筛选内生菌， 并通过溶磷、 固氮、 解钾等对菌株的促生性能进 行测定， 再通 过种子发芽实验、 盆栽实验等测定菌株对高粱的促生长能力， 筛选出具有多重促生性能且 能够促进高粱生长的菌株， 为进一步开发 高粱生长菌肥、 提高酿 酒用高粱质量和产量、 推动 酿酒行业原料的可持续发展奠定理论基础。 发明内容 [0004]本发明意在 提供一种红缨子糯高粱根内生促生菌的筛选方法及 其应用， 以提供一 种具有多重促生性能且能够促进高粱生长的菌株， 以提高 高粱质量和产量。 [0005]为了达到上述目的， 本发明提供如下技 术方案： [0006]一种红缨子糯高粱根内生 促生菌的筛 选方法， 包括以下步骤： [0007]S1、 红缨子糯高粱根处 理： 高粱根消毒后在无菌研钵中研碎； [0008]S2、 母液提取： 使用无菌水冲洗无菌研钵， 碎根和冲洗液转移到无菌三角瓶中， 无 菌三角瓶中的液体作为母液； [0009]S3、 母液稀释： 吸取一定量的母液稀释至10 ‑1的溶液A， 吸取一定量的溶液A稀释至 10‑2的溶液B,吸取一定量的溶 液B稀释至10 ‑3的溶液C； [0010]S4、 细菌培养： 分别吸取到一定量的溶液A、 溶液B和溶液C涂抹在平板上， 然后放入 培养箱进行倒置 培养； [0011]S5、 菌落保藏： 平板上挑选单菌落进行纯化， 使用LB固体培养基将菌株培养2～3d 后， 养好菌株的LB培 养基中加入甘油溶 液， 刮取菌株装 入甘油管保存； [0012]S6、 菌落分子生物学： 对菌株进行DNA提取、 DNA片段扩增 和序列比对； [0013]S7、 菌落筛选： 菌株进行解钾、 固氮、 溶磷、 产铁载体能力、 产植物激素IAA活性的分 析和植物 生长实验， 筛选出具有解钾能力、 固氮能力、 产铁载体能力、 产植物激素IAA活性高 的一种或者多种菌株。说　明　书 1/8 页 3 CN 115491308 A 3