(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211276917.5 (22)申请日 2022.10.19 (71)申请人 北京君全智药生物科技有限公司 地址 100095 北京市海淀区橙湾街9号院1 号楼5层H 502室 (72)发明人 李辰　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 赵青朵 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12N 7/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/92(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种M13噬菌 体单链DNA的制备方法 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种 M13 mp18噬菌体单链DNA的制备方法。 该方法包 括： 培养宿主菌至OD值为10~20， 按照MOI  0.1~10 接入M13噬菌体进行发酵培养； 将共培养的培养 物离心， 取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉 淀； 将沉淀物 裂解、 纯化， 获得M13  mp18噬菌体 单 链DNA。 该方法大大提升了M13噬菌体单链DNA的 表达水平， 弥补了现有技术M13噬菌体单链DNA的 表达水平低的缺点。 本发明降低了M13噬菌体单 链DNA生产成本， 提高了M13噬菌体单链DNA的经 济效益， 为其在DNA纳米折纸载体的推广应用奠 定基础， 对规模化制备DNA纳米折纸载体、 提高经 济效益具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115354041 A 2022.11.18 CN 115354041 A 1.一种M13  噬菌体单链DNA的制备 方法， 其特 征在于， 包括： 培养宿主菌 至OD值为10~20， 按照MOI  0.1~10接入M13噬菌体进行发酵培 养； 将共培养的培养物离心， 取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀； 将沉淀物裂解、 纯 化， 获得M13噬菌体单链DNA。 2.根据权利要求1所述的制备 方方法， 其特 征在于， 所述M13噬菌体为M13mp18噬菌体。 3.根据权利要求1所述的制备 方方法， 其特 征在于， 所述宿主菌为大肠杆菌 。 4.根据权利要求3所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述大肠杆菌为JM109菌株。 5.根据权利 要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述培养宿主菌至OD值为15， 接入M13 噬菌体。 6.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述MOI  为0.1。 7.根据权利 要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述发酵培养的培养基为含有5~15mM  Mg2+和 10~15mM Ca2+的 2×YT培养基。 8.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养的培养基为含有15mM  Mg2+和  15mM Ca2+的 2×YT培养基。 9.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述发酵培 养的条件为： 温度37℃， pH值7.0 0， 搅拌速率15 0~650 rpm， 溶氧值DO 20~30%。 10.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述聚乙二醇沉淀包括： 取上清液超 滤换液后， 加入聚乙二醇和NaCl， 使聚乙二醇终浓度为4wt% ‑10wt%， NaCl终浓度为0.5mmol/ L， 静置、 离心； 所述裂解采用碱进行裂解； 所述纯化为柱层 析纯化， 采用的纯化柱为Sephacryl  S‑500  HR、 Sepharose  6 FF或Capto  Core 700； 将共培养的培养物离心， 取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀； 将沉淀物裂解、 纯 化。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115354041 A 2一种M13噬菌 体单链DNA的制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 尤其涉及一种M13噬菌体单链DNA的制备 方法。 背景技术 [0002]DNA折纸术 （DNA  origami） 是DNA纳米技术的一个重要分支。 该方法发明于2006年 (Nature 2006)， 即利用上百条短单链DNA作为 “订书钉”， 辅助折叠一条长达数千碱基的噬 菌体基因组单链DNA （又称脚手架链） ， 并自组装形成预先设计的结构。 其中M13 噬菌体所携 带的单链DNA为最常用的脚手架链之一。 M13 噬菌体是一种丝状噬菌体， 内有一个环状单链 DNA分子， 含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。 其中M13mp系 列对野生型M13加以改造， 插入了多克隆位点和LacZ基因， 可容纳外源DNA300 ‑400bp， 可用于制备DNA测序时用的单链 模板和核酸探针。 [0003]M13噬菌体颗粒是丝状的， 只感染F+ （含F质粒， 能产生性菌毛） 的大肠杆菌。 感染宿 主后通常不裂解宿主细胞， 而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒， 宿主细胞仍能继续生 长和分裂。 [0004]现有技术制备M13噬菌体单链D NA时， 主要采用聚乙二醇法沉淀M 13病毒颗粒， 然后 利用乙醇沉淀法、 苯酚抽提法等有机试剂提取M13  单链DNA， 在表达方面， 无法通过设备线 性放大从而产业化且表达水平较低； 在提取方面， 通常需要 大量使用有机试剂且常常需要 ‑ 20℃预冷， 增 加了对生产车间在环保、 防爆等方面的需求， 使得工业 放大成本和风险大增。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了一种M13噬菌体单链DNA的制备方法。 该方法大大提高了 M13噬菌体单链DNA的产率， 降低了ssDNA的生产成本， 适于规模化制备DNA纳米折纸载体， 有 效地提高了经济效益。 [0006]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： 一种M13 噬菌体单链DNA的制备 方法， 包括： 培养宿主菌 至OD值为10~20， 按照MOI  0.1~10接入M13噬菌体进行发酵培 养； 将共培养的培养物离心， 取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀； 将沉淀物裂解、 纯化， 获得M13噬菌体单链DNA。 [0007]本发明中， 对M 13噬菌体的具体种类没有特殊限定， 本领域常见的M 13噬菌体均可。 在具体实施例中， 具体为M13mp18噬菌体。 [0008]本发明中， 所述宿主菌为大肠杆菌， 在具体实施例中具体为JM109菌株。 [0009]一些具体实施例中， 所述培 养宿主菌 至OD值为15， 接入M13噬菌体。 [0010]一些具体实施例中， 所述MOI  为0.1。 [0011]本发明中， 所述发酵培养的培养基为含有5~15mM Mg2+和 10~15mM Ca2+的 2×YT 培养基。 [0012]一些具体实施例中， 所述发酵培养的培养基为含有 15mM Mg2+和 15mM Ca2+的 2×说　明　书 1/7 页 3 CN 115354041 A 3