(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211295146.4 (22)申请日 2022.10.21 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 汪坤　许志国　王博　丁健　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 仇钰莹 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12N 3/00(2006.01) C12R 1/10(2006.01) (54)发明名称 一种提高地衣芽孢杆菌芽孢数量的流加补 料发酵方法 (57)摘要 本发明公开了一种提高地衣芽孢杆菌芽孢 数量的流加补料发酵方法， 属于微生物发酵技术 领域。 本发 明通过流加补料技术控制碳源和氮源 浓度促使细胞生长和芽孢形成， 增加了地衣芽孢 杆菌BF‑002细胞数量和芽孢数量。 使 地衣芽孢杆 菌细胞数量在发酵结束能达到2.88 ×1010cfu/ mL， 比前期所达到的最高细胞量提高了1.07倍。 芽孢数量达到2.56 ×1010cfu/mL， 相对于前期的 最优批次芽孢量提高了1.16倍。 本发明使用的培 养基成分来源易得且价格便宜， 工艺参数简单， 显著提高了单位产量， 降低了单位生产成本， 可 以实现大规模工业 化发酵生产。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115433699 A 2022.12.06 CN 115433699 A 1.一种提高地衣芽孢杆菌芽孢数量的发酵方法， 其特征在于， 所述方法是将地衣芽孢 杆菌在35～40℃发酵， 在地衣芽孢杆菌发酵的第6h之后开始流加含葡萄糖的补料培养基， 并控制葡萄糖在发酵体系中的终浓度为10～15g/L。 2.根据权利要求1所述的发酵方法， 其特征在于， 所述补料培养基中的碳氮比为(10～ 20)： 1。 3.根据权利要求1或2所述的发酵方法， 其特征在于， 所述补料培养基含有葡萄糖和氯 化铵。 4.根据权利要求1～3任一所述的发酵方法， 其特征在于， 所述补料培养基的流加方式 为连续流加。 5.根据权利要求4所述的发酵方法， 其特征在于， 所述补料培养基的流加时间不早于第 6h， 直至发酵第3 0h停止流加。 6.根据权利要求1～5任一所述的发酵方法， 其特征在于， 用于发酵的培养基含有鱼粉 蛋白胨、 豆粕、 氯化钠、 氯化钙、 氯化钾、 硫酸镁和一水合硫酸锰。 7.根据权利要求6所述的发酵方法， 其特征在于， 所述发酵在发酵罐中进行， 控制溶氧 在30％～50％范围内， 通 风比维持于2 ±0.2vvm， 罐压0.02Mpa～0.0 5Mpa。 8.根据权利要求1～7任一所述的发酵方法， 其特征在于， 所述地衣芽孢杆菌为地衣芽 孢杆菌BF ‑002。 9.根据权利要求1～8任一所述的发酵方法， 其特征在于， 所述地衣芽孢杆菌以种子液 的形式接种至发酵体系中， 接种后的OD达 3.5以上。 10.应用权利要求1～ 9任一所述方法制备的地衣芽孢杆菌制剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115433699 A 2一种提高地衣芽孢杆菌芽孢数量的流加补料发酵 方法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种提高地衣芽孢杆菌芽孢数量的流加补料发酵方法， 属于微生物发 酵技术领域。 背景技术 [0002]地衣芽孢杆菌是一种在土壤中大量存在的革兰氏阳性细菌。 在 生长过程中遇到不 良环境， 如营养物质匮乏、 环境pH过高或过低以及有害代谢产 物积累等， 都会促使地衣芽孢 杆菌产生内生孢子(芽孢)， 来抵抗恶劣环境。 微生态制剂， 也叫活菌制剂或生菌剂， 是指利 用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质， 经特殊工艺制成的制剂。 微生态制剂 己被应用于饲料、 农业、 医药保健和食品等各领域中。 地衣芽孢杆菌属于新型微生态制剂 菌 的一种， 不仅在养殖业中具有众多良好用处， 还在植物病害防治、 环境污染治理等方面也 发 挥着重要作用， 在使用过程中具有绿色、 高效、 污染性小的特点。 由于地衣芽孢杆菌在畜牧 业、 环境治理、 生物防治等方面具有广泛的应用性， 逐渐受到越来越多研究者的重视， 高品 质地衣芽孢杆菌菌剂的制备是当前的重点研究方向之一。 培养液中的活菌数量和芽孢数量 是地衣芽孢杆菌菌剂 重要质量指标， 其中芽孢数量尤为重要。 在菌剂生产和应用的过程中， 芽孢能够有效抵御极端环境， 在制剂、 存储和运输过程中不易失活， 能够 有效保持菌剂的活 性。 当芽孢进入动物肠道后能够快速萌发， 形成新的营养体细胞， 发挥其生理作用。 因此， 获 得含有大量芽孢的培 养液， 是提高菌剂质量的重要途经。 发明内容 [0003]本发明根据碳源和氮源浓度对地衣芽孢杆菌在芽孢形成过程中所起到的不同作 用， 提出了通过控制发酵 罐中底物基质浓度来 提高细胞量和芽孢量的流加补料 方法。 [0004]本发明提供了一种提高地衣芽孢杆菌芽孢数量的发酵方法， 所述方法是将地衣芽 孢杆菌在35～40℃发酵， 在地衣芽孢杆菌发酵的第7h开始流加含葡萄糖的补料培养基， 并 控制葡萄糖在发酵体系中的终浓度为10～15g/L。 [0005]在一种实施方式中， 用于 发酵的培养基含有 鱼粉蛋白胨、 豆粕、 氯化钠、 氯化钙、 氯 化钾、 硫酸镁和一水合硫酸锰。 [0006]在一种实施方式中， 所述发酵在发酵罐中进行， 控制溶氧在30％～50％范围内， 通 风比维持于2 ±0.2vvm， 罐压0.02Mpa～0.0 5Mpa。 [0007]在一种实施方式 中， 所述补料培 养基中的碳氮比为(10～ 20)： 1。 [0008]在一种实施方式 中， 所述补料培 养基含有葡萄糖和氯化铵。 [0009]在一种实施方式 中， 所述补料培 养基的流加方式为连续 流加。 [0010]在一种实施方式中， 所述补料培养基自发酵第7h开始流加， 直至发酵第30h停止流 加。 [0011]在一种实施方式中， 所述方法具体是： 控制发酵体系初始葡萄糖浓度20g/L， 控制 初始氨基氮浓度3.51g/L， 第7h～24h控制发酵体系中葡萄糖浓度10g/L～12g/L， 第7h～24h说　明　书 1/7 页 3 CN 115433699 A 3