(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211311822.2 (22)申请日 2022.10.25 (71)申请人 广东肇庆星湖生物科技股份有限公 司 地址 526040 广东省肇庆市端州区工农北 路67号 (72)发明人 黄永嫦　鲁立　欧雅莉　谢学敏　 黄健华　宾桂青　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 杨利娟 (51)Int.Cl. C12P 13/08(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/15(2006.01) (54)发明名称 一种游离 赖氨酸发酵 方法 (57)摘要 本发明属于发酵化工技术领域， 具体为一种 游离赖氨酸发酵方法， 其步骤为： 配制一级种子 培养基、 二级种子培养基、 发酵培养基， 这三种培 养基完全溶解后分别进行灭菌处理； 然后进行一 级种子液的培养； 将一级种子液按0.1 ‑0.2％的 体积比例接入二级种子培养基中培养对数生长 期的二级种子液， 最后将二级种子液按5 ‑20％的 体积比例接入发酵培养基中好氧 发酵， 30‑35℃、 300‑600rpm、 溶氧≥20％、 pH  7.0‑7.8、 通风比 0.5‑1.0V/V·m， 好氧发酵时间为24 ‑36h。 本发明 通过培养基成份的调整、 发酵PH环境的维持及温 和的除菌方法的改良， 得到高产的含游离赖氨酸 的发酵液， 特别适用于大生产的需要。 权利要求书2页 说明书5页 CN 115478085 A 2022.12.16 CN 115478085 A 1.一种游离 赖氨酸发酵 方法， 发酵步骤为： ①配制一级种子培养基、 二级种子培养基、 发酵培养基， 这三种培养基完全溶解后分别 进行灭菌处 理； ②将赖氨酸菌种接种于一级种子培养基中， 进行种子扩大培养， 得到对数生长期的一 级种子液； ③将步骤②的一级种子液按0.1 ‑0.2％的体积比例接入二级种子培养基中， 28 ‑32℃， 150‑300rpm， 通风比0.3 ‑0.5V/V·m， pH7.15‑7.2， 培养14 ‑20h， 得到对数生长期的二级种子 液； ④将步骤③的二级种子液按5 ‑20％的体积比例接入发酵培养基中好氧发酵， 30 ‑35℃、 300‑600rpm、 溶氧≥20％、 pH  7.0‑7.8、 通风比0.5 ‑1.0V/V·m， 好氧发酵时间为24 ‑36h， 发 酵过程利用补料调控pH； 发酵过程中流加葡萄糖溶液， 葡萄糖溶液质量百分浓度控制在 0.5‑1.5％； 所述步骤 ①中一级种子培养基的灭菌方法是蒸汽灭菌法， 条件为121.0 ‑123.0℃， 维持 20‑30分钟， 压力0.105 ‑0.12Mpa； 所述二级种子培养基与发酵培养基溶解后采用无机膜过 滤进行除菌 。 2.根据权利要求1所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 所述步骤 ④调控pH是指发 酵罐压0.05Mpa， 发酵温度控制30 ‑35℃， 发酵初时pH在7.4 ‑7.5范围， 发酵过程中通过补充 100‑200g/L的氮源水 溶液保持pH在7.4 ‑7.8的范围。 3.根据权利要求1所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 所述步骤 ①无机膜条件为 0.22um的0.5 ‑30M2无机膜， 在0.4 ‑1.0Mpa压力条件 且室温下 过滤。 4.根据权利要求3所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 步骤 ②中的赖氨酸菌种为 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium  glutamicum)。 5.根据权利要求4所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 步骤 ②所述的一级种子培 养基组成： 每100mL培养基中含葡萄糖2g,玉米浆干粉1g， 酵母浸粉0.5g， KH2PO4 0.2g， K2HPO40.5g， MgSO4 0.1g,饮用水定容10 0mL， 调pH7.0 。 6.根据权利要求5所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 步骤 ②所述的菌种接种于 一级种子培养基时， 先将赖氨酸菌种进行试管斜面活化扩大培养， 再取菌苔洗脱液接入一 级种子培养基中； 步骤 ②所述的试管斜面培养基组成为每100 mL斜面培养基中含葡萄糖2g, 玉米浆干粉1g， 酵母浸粉0.5g， KH2PO4 0.2g， K2HPO4 0.5g， MgSO4 0.1g,琼脂2g， 饮用水定容 100mL， pH7.0 。 所述的活化方法为： 以冻干菌粉或甘油保存菌液为出发， 接种试管斜面培养基， 28 ‑32 ℃， 培养1天。 斜面试管种子用10ml无菌水洗脱菌苔， 按体积比0.01 ‑0.1％的比例接入一级 种子培养基中， 3 0‑32℃， 100rpm培养6‑12小时。 7.根据权利要求6所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 步骤 ③所述的二级种子培 养基组成为每100mL种子培养基中含葡萄糖3g,玉米浆干粉0.3g， 蛋氨酸0.1g， 异亮氨酸 0.1g， 尿素0.5g， KH2PO4 0.3g， K2HPO4 0.5g， MgSO4 0.1g,硫胺素100mg/L， 生物素10mg/L， 饮 用水定容10 0mL， pH自然。 8.根据权利要求7所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 步骤 ④所述的发酵培养基 组成为每100mL培养基中含葡萄糖6 ‑8g,尿素0.3g， 蛋氨酸0.02g， 异亮氨酸0.02g， 亮氨酸权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115478085 A 20.01g， 谷氨酸0.5g， 半胱氨酸0.05g， KH2PO4 0.3g， K2HPO4 0.5g， MgSO4 0.1g， 硫酸锰0.01g， 硫酸亚铁0.01g， 硫酸锌0.02g， 硫胺素200ug/L， 生物素100ug/L， 烟酰胺10mg/L， 核黄素 10mg/L， 油酸0.2g， 饮用水定容10 0mL， pH7.0 。 9.根据权利要求8所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 所述步骤 ④的氮源水溶液 是尿素、 氨水、 液氨、 碳 酸氢铵、 醋酸铵中的至少一种。 10.根据权利要求8所述的游离赖氨酸发酵方法， 其特征在于： 所述步骤 ④的氮源水溶 是尿素、 氨水、 液氨中的至少一种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115478085 A 3