(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211312714.7 (22)申请日 2022.10.25 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M202 21140 2022.07.21 (71)申请人 湖南省农业环境 生态研究所 地址 410125 湖南省长 沙市芙蓉区马坡岭 远大二路5 60号大院内 (72)发明人 鲁耀雄　张嘉超　李超　高鹏　 崔新卫　谢坤英　 (74)专利代理 机构 深圳峰诚志合知识产权代理 有限公司 4 4525 专利代理师 张腾 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01)A01N 63/22(2020.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1及其分离筛选 与鉴定方法和应用 (57)摘要 本发明属于微生物 技术领域， 具体涉及一种 贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1及其分离筛选与鉴定方 法和应用。 所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1在中国典 型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC   M20221140， 保藏机构地址： 湖北省武汉市 武昌区 八一路299号。 本发明贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1对 百合枯萎病主要致病菌 ‑尖孢镰刀菌的抑菌效果 较强， 并对百合的土传病原真菌三线镰刀菌、 茄 腐镰刀菌、 链格孢、 齐整小核菌、 疫霉菌、 青霉和 黑曲霉都具有较好的拮抗效果， 抑制率均在75％ 以上， 具有高效广谱抗土传病原真菌的能力； 本 发明方法能够有效从蚯蚓肠道中分离、 纯化、 筛 选和鉴定贝莱斯芽孢杆菌Y FB3‑1， 本发明方法易 于操作， 能够快速分离蚯蚓肠道内含物， 通过筛 选和鉴定能够准确可靠得到所述贝莱斯芽孢杆 菌YFB3‑1。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 115537358 A 2022.12.30 CN 115537358 A 1.一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1， 其特征在于， 所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1在中国典型 培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC  M20221140， 保藏机构地址： 湖北省武汉市武昌区八一 路299号。 2.根据权利1所述的一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1， 其特征在于， 所述贝莱斯芽孢杆菌 YFB3‑1菌落为乳白色， 无光 泽， 表面皱褶， 边 缘隆起不整齐， 中间凹陷。 3.一种用于分离筛选和鉴定权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1的方法， 其特征在 于， 包括如下步骤： (1)分离： 用无菌水清洗蚯蚓表面， 然后用酒精对蚯蚓体表消毒并致其死亡， 接着解剖 取出蚯蚓肠道内含物； (2)纯化： 将步骤(1)得到的含物加入到装有经过灭菌处理的无菌水三角瓶中， 振荡后 制成悬液， 再用无菌水将悬液稀释成10‑3梯度的稀释液、 10‑4梯度的稀释液和10‑5梯度的稀 释液； 将稀释后的10‑3梯度的稀释液涂布在NA培养基的平板上进行培养， 将稀释后的10‑4梯 度的稀释液涂布到孟加拉红琼脂培养基的平板上进行培养， 将稀释后的10‑5梯度的稀释液 涂布到改良高氏一号培养基的平板上进行培养； 然后挑取三种培养基平板上长势好的单菌 落进行划线纯化菌株； (3)筛选： 将百合尖孢镰刀菌在PDA上进行活化， 接着用打孔器在活化后的菌落边缘进 行打孔， 并取菌饼； 将菌饼上长有菌丝的一面朝下转接到新PDA平板中央， 然后采用十字交 叉法点样分离纯化好的菌株进行培养并筛选出对百合病原真菌尖孢镰刀菌拮抗作用最强 的拮抗菌株； (4)鉴定： 将步骤(3)所筛选出的拮抗菌株进行形态学鉴定， 然后进行分子生物学鉴定， 鉴定出所述贝莱斯芽孢杆菌 YFB3‑1。 4.根据权利要求3所述方法， 其特 征在于， 步骤(1)中所述酒精的体积分数为75％。 5.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述振荡 时间为15 ‑45min， 所述NA 培养基的成分包括： 蛋白胨7.5 ‑15g， 牛肉膏2 ‑5g， NaCl 3‑6g， 琼脂18 ‑22g， 去离子水 1000mL； 所述孟加拉红琼脂培养基成分包括： 蛋白胨3 ‑8g， 葡萄糖8 ‑12g， MgSO4·7H2O0.25‑ 1.5g， K2HPO4 1.0g， 孟加拉红0.015 ‑0.045g， 琼脂18 ‑22g， 去离子水1000mL， 质量浓度为1％ 的链霉素溶液2 ‑5mL； 所述高氏1号培养基的成分包括： KNO3 0.5‑1.5g， 可溶性淀粉18 ‑22g， K2HPO40.25‑1g， MgSO4·7H2O 0.25‑1g， NaCl 0.25‑1.5g， FeSO4·7H2O 0.005‑0.015g， 琼脂18 ‑22g， 去离子水1000mL； 所述培 养温度为25 ‑45℃。 6.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述PDA的制备方法为： 将马铃薯 去皮切块并称取100 ‑300g， 加水煮沸25 ‑45min后制成浸汁， 然后加入葡萄糖18 ‑22g， 琼脂 18‑22g， 加去离 子水定容至10 00mL； 所述培 养温度为25 ‑45℃。 7.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 步骤(4)中所述形态学鉴定的方法为： 将拮抗 菌划线到所述NA培养基固体平板上， 在25 ‑45℃条件下恒温培养箱中培养2 ‑5天， 并且记录 有单菌落的菌落形态， 然后采用革兰氏染色法对菌体染色， 观察菌体的形态特征以及扫描 电镜观察菌体形态和测量大小进行形态学鉴定； 所述分子生物学鉴定的方法为： 采用细菌 16S rDNA基因片段的通用引物扩增， 然后进行基因测序进行分子生物学鉴定 。 8.一种利用权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌 YFB3‑1在防治百合 枯萎病上的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115537358 A 2一种贝莱斯芽孢杆菌YF B3‑1及其分离筛选与鉴定方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌  YFB3‑1及其分离筛 选与鉴定方法和应用。 背景技术 [0002]百合枯萎病又称根腐病、 茎腐病， 是百合生产栽培中最为严重、  造成经济损失最 大的一种真菌性病害， 具有危害大、 分布广、 防治难  等特点， 严重影响了百合的产量和品 质， 阻碍了百合产业的发展。 镰  刀菌引起的百合枯萎病是其栽培过程中最为普遍和严重 的。 在百合栽  培过程中的任何温度和 湿度条件下， 镰刀菌都能够有效存活或者进行  生长 繁殖， 因此， 百合在整个生长周期均可能被染病。 连作百合的枯  萎病具有发生广泛、 发病严 重、 防治困难等特点， 造成产量和品质急  剧下降， 已成为百合种植及其相关产业发展的主 要限制因素， 因此，  防治百合 枯萎病已经成为 其种植过程中面临的主 要难题。 [0003]蚯蚓是土壤动物中生物量最大的物种， 对土壤生态系统的物质循  环和能量转换 起着重要的作用， 对维持土壤生态系统的结构和功能起  着重要的调控作用， 蚯蚓是土壤改 良的“工程师”， 与微生物具有互  作关系， 通过其肠道将随食物进入体内的部 分微生物被杀 死， 与蚯蚓  存在互利共生的微生物会成为优势菌群， 在蚯蚓肠道内迅速扩繁， 并  且通过其 挖掘和排泄有利于在土壤中进一步繁殖和传播， 改变了土壤  微生物群落结构和组成。 蚯蚓 肠道中分离出的菌群与土壤和新鲜的蚯  蚓粪的菌群存在显著差异， 主要有四个生理类群， 即植物生长促进剂、  游离活氮固化剂、 杀菌剂和磷酸盐溶解剂。 [0004]蚯蚓可以通过直接或间接作用影响了微生物组成、 丰富度和活性，  进而有效调节 土壤的微 生态系统， 促进土壤养分循环， 提高土壤生物  肥力， 并且 减少作物枯萎病的发生。 [0005]因此， 利用蚯蚓调控土壤微生态环境成为了缓解作物连作障碍的  新途径。 其肠道 内是否具有高效拮抗百合尖孢镰刀菌的微生物以及其  作用和运用方向成为目前研究 的主 要发展方向。 发明内容 [0006]针对上述缺点， 本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1及其 分离筛选与鉴定 方法和应用。 本发 明贝莱斯芽孢杆菌YFB3 ‑1对百合 枯萎病主要致病菌 ‑尖孢镰刀菌的抑菌 效果较强， 并对百合的土传病  原真菌三线镰刀菌、 茄腐镰刀菌、 链格孢、 齐整小核菌、 疫霉 菌、 青 霉和黑曲霉都具有较好的拮抗效果， 抑制率均在75％以上， 具有高效  广谱抗土传病 原真菌的能力； 本发明方法能够有效从蚯蚓肠道中分离、  纯化、 筛选和鉴定贝莱斯芽孢杆 菌YFB3‑1， 本发明方法易于操作，  能够快速分离蚯蚓肠道 内含物， 通过筛选和鉴定能够准 确可靠得到所  述贝莱斯芽孢杆菌 YFB3‑1。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0008]一种贝莱斯芽孢 杆菌YFB3 ‑1， 其特征在 于， 所述贝莱斯芽孢 杆 菌YFB3‑1在中国典 型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC  M 20221140， 保藏机构地址： 湖北省武汉市武昌区说　明　书 1/7 页 3 CN 115537358 A 3