(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211326779.7 (22)申请日 2022.10.25 (71)申请人 浙江省农业科 学院 地址 310021 浙江省杭州市江干区石桥路 145号 (72)发明人 黄叶娥　刘燕　鲍国连　崔雪梅　 季权安　 (74)专利代理 机构 北京华清迪源知识产权代理 有限公司 1 1577 专利代理师 丁彦峰 (51)Int.Cl. A61K 39/02(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12N 1/20(2006.01)C12N 1/02(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其 制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄 多糖产品及其制备方法和应用， 具体涉及免疫生 物学领域。 包括步骤一， 采用超滤浓缩法制备波 氏杆菌外膜囊泡； 步骤二， 采用薄膜分散法结合 超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂； 步骤三， 将 制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫 佐剂等体积混合后， 通过装有聚碳酸酯膜的纳米 粒挤压器进行融合， 经挤压器来回挤压， 即得细 菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品。 本发明采用超 滤法制备的了波氏杆菌的外膜囊泡， 并将其通过 挤压器， 反复挤压， 与纳米地黄多糖相结合， 构建 针对波氏杆菌的纳米亚单位疫苗， 旨在增强单独 外膜囊泡的稳定性， 改善其免疫效果。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115531527 A 2022.12.30 CN 115531527 A 1.一种细菌 外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备 方法， 其特 征在于， 包括： 步骤一， 采用超滤浓 缩法制备波氏杆菌 外膜囊泡； 步骤二， 采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂； 步骤三， 将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后， 通过装 有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进 行融合， 经挤压器来回挤压， 即得细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄 多糖产品。 2.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备方法， 其特征在 于， 所述超滤浓缩法为先将单个菌落进 行扩大培养； 再将扩大培养的滤液进行离心、 过滤后 超滤、 浓缩； 浓缩液离心后重悬， 得波氏杆菌 外膜囊泡。 3.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备方法， 其特征在 于， 所述扩大培 养时， 培养液中添加头孢 氨苄64 μg/mL。 4.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备方法， 其特征在 于， 所述过 滤后超滤的条件为过 滤是经过0.45 μm的滤器； 超滤装置的截留分子量 为100kDa。 5.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备方法， 其特征在 于， 所述重悬为TE缓冲液重悬或PBS缓冲液重悬。 6.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备方法， 其特征在 于， 所述薄膜分散法结合超声法包括： 大豆卵磷脂、 胆固醇和DSPE ‑PEG 2000溶于甲醇和氯仿混合液中， 搅拌溶解， 减压旋转 蒸发除去 有机溶剂； 瓶壁形成一层均匀的薄膜后， 导入熟地多糖的水溶液， 水化后继续旋蒸； 瓶壁薄膜完全 洗脱， 加入d dH2O继续旋转蒸发； 蒸发结束后， 利用探头式超声细胞粉碎机进行超声粒径均一化处理， 再将粒径均一化 处理的溶液挤压过微 孔滤膜， 得纳米地黄多糖免疫佐剂。 7.根据权利要求6所述的一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备方法， 其特征在 于， 所述探 头式超声细胞粉碎机得强度40％， 10s开， 10s停， 工作时间2mi n。 8.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制备方法， 其特征在 于， 所述聚碳 酸酯膜得 粒径为20 0nm。 9.一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品， 其特征在于， 是由权利要求1 ‑8任一方法制 备而成。 10.一种细菌 外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品在制备纳米亚单位疫苗中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115531527 A 2一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及免疫生物学领域， 具体涉及一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品及 其制备方法和应用。 背景技术 [0002]细菌外膜囊泡(outer  membranevesicles， OMVs)是由革兰阴性细菌以出芽的方式 分离出来的直径为20～300nm的球形双层纳米结构。 细菌产生的膜囊泡保留了源细菌的理 化特性， 但不能再生和复制。 [0003]由于OMVs中的膜相关 蛋白和毒力因子可诱导细胞产生免疫 反应， 表明OMVs可以作 为免疫原性物质刺激组胞阻止病原体入侵。 因此， 具有高免疫原性和非复制性的OMVs是疫 苗的优良候选者之一。 [0004]目前波氏杆菌疫苗都是灭活苗， 虽能使机体产生抗体， 但持续时间短， 保护率低， 不能有效抵御再次感染。 发明内容 [0005]为此， 本发明提供一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用， 以 解决现有 波氏杆菌疫苗持续时间短， 保护率低， 不能有效抵御再次感染等问题。 [0006]为了实现上述目的， 本发明提供如下技 术方案： [0007]根据本发明的第一方面提供一种细菌外膜囊泡 ‑纳米地黄多糖产品的制 备方法， 包括： [0008]步骤一， 采用超滤浓 缩法制备波氏杆菌 外膜囊泡； [0009]步骤二， 采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂； [0010]步骤三， 将制 得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后， 通 过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进 行融合， 经挤压器来回挤压， 即得细菌外膜囊泡 ‑纳米 地黄多糖产品。 [0011]进一步的， 所述超滤浓缩法为先将单个菌落进行扩大培养； 再将扩大培养 的滤液 进行离心、 过 滤后超滤、 浓 缩； 浓缩液离心后重悬， 得波氏杆菌 外膜囊泡。 [0012]进一步的， 所述扩大培 养时， 培养液中添加头孢 氨苄64 μg/mL。 [0013]进一步的， 所述过滤后超滤的条件为过滤是经过0.45μm的滤器； 超滤装置的截留 分子量为100kDa。 [0014]进一步的， 所述重悬为TE缓冲液重悬或PBS缓冲液重悬。 [0015]进一步的， 所述薄膜分散法结合超声法包括： [0016]大豆卵磷脂、 胆固醇和DSPE ‑PEG 2000溶于甲醇和氯仿混合液中， 搅拌溶解， 减压 旋转蒸发除去 有机溶剂； [0017]瓶壁形成一层均匀的薄膜后， 导入熟地多糖的水溶液， 水化后继续旋蒸； 瓶壁薄膜 完全洗脱， 加入d dH2O继续旋转蒸发；说　明　书 1/6 页 3 CN 115531527 A 3