(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211329328.9 (22)申请日 2022.10.27 (71)申请人 贵州万益康微生物科技有限公司 地址 551700 贵州省毕节市金海湖新区第 一产业园 (72)发明人 刘富金　王欢　周粉群　陈秀梅　 (74)专利代理 机构 重庆以知共创专利代理事务 所(普通合伙) 50226 专利代理师 钟亮 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) (54)发明名称 土壤分离培育乳酸菌制作方法 (57)摘要 本发明公开了一种土壤分离培育乳酸菌制 作方法， 包括以下步骤： S1： 在没有受过化肥农药 及各种工业污染的深林土壤中， 选择土壤深处 10‑30公分含有乳白色的菌丝的位置作为投放采 集乳酸菌培养基采集点。 本发明通过从土壤中提 取乳酸菌并应用到土壤中， 有利于增加土壤微生 物菌群数量， 提高土壤活性， 改良土壤， 分解农 残， 分解土壤有机质， 释放各种营养成份有利于 植物吸收， 通过土壤微生物不断增多， 能抑制各 种病原菌， 减少农作物病虫害发生， 从而减少农 药使用量， 提高农作物产量和 品质， 提高农产品 经济效益。 权利要求书2页 说明书4页 CN 115505533 A 2022.12.23 CN 115505533 A 1.土壤分离 培育乳酸菌制作方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1： 在没有 受过化肥农药及各种工业污染的深林土壤中， 选择土壤深处10 ‑30公分含有 乳白色的菌 丝的位置作为投放采集乳酸菌 培养基采集 点； S2： 选取45％ ‑50％含水量的培养基， 培养基原料： 玉米面、 大米， 玉米面用水拌湿， 含水 量45％‑50％， 大米用水浸泡 1‑2小时， 浸泡后过滤， 用拌湿玉米面与浸泡过滤大米同时倒入 到搅拌箱内进 行搅拌混合， 且玉米面和大米比例按照1： 1添加， 搅拌混合后， 得到培养基， 倒 入到纱布袋中， 并对纱布袋用麻绳系紧封口； S3： 将S2中封口后的纱布带放入到温度 为120‑130℃的高压灭菌锅灭菌2 ‑2.5h， 灭菌完 成后， 取出放入到无菌 室内进行自然冷却到30 ‑35℃， 然后装入灭过菌的培养箱中用宣纸盖 上； S4： 将S3中所述的培养箱带到S1中所述的乳酸菌培养基采集点， 让土壤周围有益菌落 进入培养箱增大繁殖， 其中繁殖时间为春秋5 ‑7天， 夏天3 ‑5天； S5： 打开S4中所述的培养箱， 观察培养基上有乳白色或红色的菌落出现就证明有大量 有益菌群繁殖， 这时把培养箱取回实验室， 将培养基取出倒入到搅拌箱中， 并放入1： 1比例 的红糖， 进行搅拌混合， 搅拌混合均匀后装入灭好菌的陶瓷坛7天后添加3倍植物营养液二 次培养， 培养15天后， 使用过 滤网进行 过滤， 得到原种， 其原种为混合菌群； S6： 将需要用到的胶头滴管和采集管放入到高压灭菌锅中进行灭菌， 制备人员佩戴好 无菌手套以及口罩进入到S5中的原种库房内， 使用灭菌后的采集管进行采样； S7： 使用电子称称取8.5g的NaCl倒入到盛放有1L的蒸馏水的烧杯中进行溶解， 使用量 杯量取45ml生理盐水， 并倒入100ml的锥形瓶中， 并使用8层纱布和一层牛皮纸对锥形瓶进 行包扎， 采用量杯多次量取9ml生理盐水， 倒入口径 为18mm的试管中， 并用橡皮塞塞紧， 放入 到温度为121℃的高压灭菌锅中进行灭菌20mi n， 得到灭菌后的生理盐水； S8： 采用电子秤准确称量乳酪蛋白胨10.0g、 牛肉提取物10.0g、 酵母提取物5.0g、 葡萄 糖5.0g、 醋酸钠5.0g、 柠檬 酸二胺2.0g、 T ween80 1.0g、 K2HPO4 2.0g、 MgSO4H2O  0.05g、 琼脂 15.0g， 并将称量好的物质倒入到容量为1L的玻璃烧杯内， 向玻璃烧杯内加入适量蒸馏水， 紧接着将玻璃烧杯放置在到磁力搅拌器上搅拌溶解3min， 向玻璃烧杯中补水至1L， 搅拌完 成后， 将混合物分装于两个容量为1L的锥形瓶内， 并放入到温度为 121℃的高压灭菌锅中进 行灭菌20min， 灭菌完成后， 取出放入到无菌室内进行自然冷却， 待温度降到50 ‑60℃， 得到 培养基， 将培 养基倒入到超净工作台的平板上， 且每 个平板上倒入培 养基的量 为25ml； S9： 使用量杯量取5mlS5中制 得的原种， 并量取45mlS7中制 得的生理盐水， 同时倒入到 烧杯中， 使用振荡器进行振荡混匀制得10‑1稀释液， 用移液枪吸取1ml  10‑1稀释液于装有 9ml生理盐水的试管中混匀制得10‑2稀释液， 紧接着用移液枪吸取1ml  10‑3稀释液于装有 9ml生理盐水的试 管中混匀制得10‑4稀释液， 依次类 推， 依次制备10‑6、 10‑7……的稀释液； S10： 选取S9中制得的合适的稀释液在灭过菌的超净工作台中使用灭菌后的涂布棒进 行涂布， 待涂布 平板上的菌 长起来后， 使用在酒精灯火焰上灼烧后的接种针进行挑菌划线； S11： 使用电子秤称 取豆粕10.0g、 米粉 15.0g、 麸皮10g、 白糖20.0g和蛋白胨5.0g于容量 为1L的玻璃烧杯中， 并将烧杯放置在温度为80℃， 转速为110rpm 的磁力搅拌器上进行搅拌 溶解5min， 溶解后使用锥形瓶进 行分装， 紧接着将分装后的锥形瓶放入到温度为 121℃的湿 热高压蒸汽灭菌锅内灭菌20min， 灭菌完成后， 放入到灭菌过的超净工作台内进行接种， 接权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115505533 A 2种后使用灭菌后的纸和绳子配合进行包扎， 并放入到恒温振荡器内进行摇床培 养； S12： 将S1 1中摇床培 养后的培 养基装瓶送到第三方检测机构进行菌种鉴定； S13： 将S12中鉴定后的菌种接种于斜面培养基内， 培养， 并用石蜡覆盖， 在标签上写好 信息， 放入 冰箱进行保藏。 2.根据权利要求1所述的土壤分离培育乳酸菌制作方法， 其特征在于， 所述S2中， 纱布 袋子的尺寸 为25cm×15cm。 3.根据权利要求1所述的土壤分离培育乳酸菌制作方法， 其特征在于， 所述S3中， 培养 箱的尺寸为长30cm,宽20cm,深16cm， 其灭菌的方法为： 放入到温度为120 ‑125℃的高压灭菌 锅中灭菌 30‑35min， 然后取 出， 放在无菌室冷却至20 ‑25℃即可。 4.根据权利要求1所述的土壤分离培育乳酸菌制作方法， 其特征在于， 所述S8中， 磁力 搅拌器的温度为80℃、 转速为120rpm。 5.根据权利要求1所述的土壤分离培育乳酸菌制作方法， 其特征在于， 所述S8中， 平板 的数量为10个， 在使用前， 将10个平板用报纸包裹， 放入到温度为121℃的湿热高压灭菌锅 内灭菌15mi n， 灭菌后放入到温度为6 0℃的烘干箱内烘干20mi n。 6.根据权利要求1所述的土壤分离培育乳酸菌制作方法， 其特征在于， 所述S10中， 涂布 棒在使用前， 使用75％的酒精浸泡20 ‑30min， 然后将其过酒精灯火焰， 等涂布棒冷却至25 ‑ 30℃时再使用。 7.根据权利要求1所述的土壤分离培育乳酸菌制作方法， 其特征在于， 所述S8中， 超净 工作台使用前将无菌操作室、 更衣间、 缓冲间和更鞋间的紫外灯打开， 照射20 ‑30min进行杀 菌， 紧接着开启超 净工作台上的工作电源， 关闭紫外灯， 并用75％的酒精喷洒擦拭消毒工作 台面， 在实验结束后， 用消毒液擦拭工作台面， 关闭工作电源， 重新开启紫外灯照射15 ‑ 20min进行灭菌 。 8.根据权利要求1所述的土壤分离培育乳酸菌制作方法， 其特征在于， 所述S12中， 装瓶 的瓶子为灭菌后的瓶子， 其灭菌的方式为放入到温度为121℃的湿热高压灭菌锅内灭菌 15min， 拿出自然冷却， 即可使用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115505533 A 3