(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211335739.9 (22)申请日 2022.10.28 (71)申请人 内蒙古大学 地址 010000 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区大学西路23 5号 (72)发明人 郝慧芳　肖金洋　段晓姣　刘晓飞　 王树明　刘佳慧　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 一种无乳链球菌释放的细胞质膜囊泡的提 取方法 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 具体涉及一种无 乳链球菌释放的细胞质膜囊泡的提取方法。 本发 明将无乳链 球菌接种到培养基中， 培养至OD600为 0.8～1.0， 收集培养液上清； 依次对所述培养液 上清进行过滤、 浓缩和离心， 得沉淀； 所述沉淀即 为所述细胞质膜囊泡。 本发明所述提取方法操作 简便， 首次从无乳链球菌中提取得到杂质含量 低， 浓度高的细胞质 膜囊泡， 填补无乳链球菌细 胞质膜囊泡提取方面的空缺， 为进一步研究无乳 链球菌细胞质膜囊泡的相关作用奠定 了基础。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 115478039 A 2022.12.16 CN 115478039 A 1.一种无乳链球菌释放的细胞质膜囊泡的提取 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 将无乳链球菌 接种到培养基中， 培 养至OD600为0.8～1.0， 收集培 养液上清； 依次对所述培 养液上清进行 过滤、 浓缩和离心， 得沉淀； 所述沉淀为所述细胞质膜囊泡。 2.根据权利要求1所述的提取 方法， 其特 征在于， 所述培 养基包括TSB培 养基。 3.根据权利 要求1所述的提取方法， 其特征在于， 所述培养的温度为37℃， 转速为150～ 200rpm。 4.根据权利要求1所述的提取方法， 其特征在于， 所述过滤包括使用0.22μm细菌过滤 器。 5.根据权利要求1所述的提取方法， 其特征在于， 所述浓缩包括100KDa超滤浓缩； 所述 浓缩前液体与浓 缩后液体的体积比为6： 1。 6.根据权利要求1所述的提取方法， 其特征在于， 所述离心的转速为150000～ 200000xg， 时间为1.5～ 2h， 温度为 4℃。 7.根据权利要求1所述的提取方法， 其特征在于， 所述收集培养液上清的方式包括对培 养液离心； 所述离心的转速为5 000～8000xg， 时间为20～3 0min， 温度为 4℃。 8.根据权利要求1所述的提取方法， 其特征在于， 得所述沉淀后， 还包括： 利用溶剂重悬 沉淀， 得到 重悬液； 使用0.2 2 μm细菌过 滤器过滤所述重悬 液。 9.根据权利要求8所述的提取 方法， 其特 征在于， 所述溶剂包括PBS。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478039 A 2一种无乳链球菌释 放的细胞质膜囊泡的提取方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种无乳链球菌释放的细胞质膜囊泡的提取 方法。 背景技术 [0002]细胞外囊泡可由几乎所有种类微生物或哺乳动 物细胞产生， 是细菌与细菌之间以 及细菌与宿主细胞间相互交流及作用的一种介质。 早在1976年Allan等发现红细胞从其表 面释放细胞外囊泡(EV)， 对于细菌而言， 革兰氏阴性菌来源的EV形成机制 有2种途径： 外膜 起泡和爆炸性细菌裂解， 其中外膜囊泡(Outer  Membrane  Vesicles， OMVs)是外膜起泡形成 的， 其内膜保持完整， 不包含细胞质成分； 外 ‑内膜囊泡(Outer ‑Inner Membrane Vesicles， OIMVs)和爆炸性外膜囊泡(Explo sive Outer Membrane Vesicles， EOMVs)是爆炸性细菌裂 解形成的， E MOVs随机含有细胞质成分。 [0003]革兰氏阳性菌来源的EV形成机制尚不完全清楚， 有学者发现可能与内溶素引发的 “鼓泡细胞死亡 ”有关， 在这过程中产生细胞质膜囊泡(Cytoplasmic  Membrane  Vesicles， CMVs)， 但是仅停 留在理论阶段， 并且产生的细胞质膜囊泡含有膜和细胞质成分， 并未有关 于如何高效提取细胞质膜囊泡(C MVs)， 减少杂质的相关记载。 [0004]无乳链球菌(Streptococcus  agalactiae,S.agalactiae)又叫B族链球菌(GBS)， 是一种人畜及水产共患病原体， 是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌， S.agalactiae可以导致奶 牛乳腺炎， 罗非鱼脑部病变， 新生儿脑膜炎， 孕妇生殖道疾病及成人 的肺炎等， 提取杂质少 的S.agalactiae  CMVs， 并对其致病机制进行探究有利于临床中关于孕妇及新生儿疾病的 治疗， 并填补S.a galactiae  CMVs提取方面的空缺。 发明内容 [0005]本发明的目的在于弥补现有技术的不足， 从无乳链球菌中提取得到细胞质膜囊 泡， 并且杂质含量低， 浓度高。 [0006]本发明提供了一种无乳链球菌释放的细胞质膜囊泡的提取 方法， 包括如下步骤： [0007]将无乳链球菌 接种到培养基中， 培 养至OD600为0.8～1.0， 收集培 养液上清； [0008]依次对所述培 养液上清进行 过滤、 浓缩和离心， 得沉淀； [0009]所述沉淀即为所述细胞质膜囊泡。 [0010]优选的， 所述培 养基包括TSB培 养基。 [0011]优选的， 所述培 养的温度为37℃， 转速为15 0～200rpm。 [0012]优选的， 所述过 滤包括使用0.2 2 μm细菌过 滤器。 [0013]优选的， 所述浓缩包括100KDa超滤浓缩； 所述浓缩前液体与浓缩后液体的体积比 为6： 1。 [0014]优选的， 所述离心的转速为15 0000～200000xg， 时间为1.5～ 2h， 温度为 4℃。 [0015]优选的， 所述收集培养液上清的方式包括对培养液离心； 所述离心的转速为5000说　明　书 1/5 页 3 CN 115478039 A 3