(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211362943.X (22)申请日 2022.11.02 (71)申请人 中国农业科 学院农业环境与可持续 发展研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 于佳动　赵立欣　黄越　姚宗路　 罗娟　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 刘竹 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C12R 1/225(2006.01)C12R 1/23(2006.01) C12R 1/24(2006.01) (54)发明名称 一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌 群方法 (57)摘要 本发明属于微生物 技术领域， 公开了一种未 灭菌条件构建产乳酸 ‑乙酸微生物菌群方法， 包 括S1正向构建菌群： S1.1选择原菌源， 将其接种 后进行限制性培养； S1.2接种传代培养， 筛选复 杂菌系； S1.3调节复杂菌系浓度； S2反向构建菌 群： S2.1将德氏乳杆菌保加利亚亚种、 嗜酸乳杆 菌、 短乳杆菌、 布氏乳杆菌分别接种后培养得到 复合菌； S2.2调节复合菌系浓度； S3菌群的组配： S3.1不同目标产物组配： S3.2按体积比组配； S3.3厌氧发酵； S3.4复合菌系再次组配， 培养得 到所需菌系； 本发明利用自然条件 下培养筛选复 杂菌群， 结合已知菌群组配菌系， 协同产酸， 提升 秸秆水解 酸化体系产酸潜力。 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 CN 115466704 A 2022.12.13 CN 115466704 A 1.一种未灭菌条件构建产乳酸 ‑乙酸微生物菌群方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： S1、 正向构建菌群： S1.1选择深度为5、 25、 45、 65、 85cm且有机质含量达到40 ×10‑3的酸性土壤或常温下微 好氧发酵24h~72h后有明显酸味的东北泡菜或品质优良的黄贮秸秆中的任一一种含有乳酸 菌的丰富菌群作为原菌源， 未灭菌条件下将原菌源在30℃~37℃下接种至改良的选择性培 养基中进行恒温静置 培养； S1.2以体积分数比为10%~20%的接种比进行接种， 传代培养10~30代， 初始培养菌群生 长速度较慢， 第1~4代培养时间为72h； 自第5代 开始， 菌群适应培养基环 境且处于活跃状态， 第5~30代的培养时间为36h； 筛选出pH在10代以内迅速下降到4.5及以下的、 处于对数期生 长的菌群即培养基混浊未分层、 菌群组成稳定的三种复合菌系： ①单产乳酸产量大于等于 5g/L且乳酸占总挥发酸30%及以上的复杂菌系Z1、 ②单产乙酸产量大于等于1.5g/L且乙酸 占总挥发酸35%及以上的复杂菌系Z2、 ③乳酸和乙酸协同生产总产量大于等于6.5g/L且乳 酸和乙酸占总挥发酸的50%及以上复杂菌系Z3； 连续5代以上满足限定条件的即为驯化培养 成功； S1.3取S1.2筛选出的复杂菌系离心去掉上清液， 用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为 1010 cfu/mL； S2、 反向构建菌群： S2.1将同型产乳酸菌： 德氏乳杆菌保加利亚亚种、 嗜酸乳杆菌， 异型产乳酸菌： 短乳杆 菌、 布氏乳杆菌分别接种在优化的MRS培养基上进行活化培养24h~72h， 活化培养好的复合 菌系命名为F1、 F2、 F3、 F4； 其中， 所述德氏乳杆菌保加利亚亚种来自中国农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编 号为ACCC  05468； 所述嗜酸乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号为 ACCC 19887； 所述短乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号为ACCC   05488， 所述布氏乳杆菌来自中国普通 微生物菌种保藏中心， 保藏编号 为CGMCC 1.15607； S2.2取S2.1活化培养后的复合菌液离心去掉上清液， 用生理盐水重悬将菌液浓度统一 调为1010 cfu/mL； S3、 菌群的组配： S3.1不同目标产物下的组配： S3.1.1以乳酸为目标产物的组配， 选取S1.2中的Z1与S2.1中的F1或F2进行组配： Z1+ F1、 Z1+F2； S3.1.2以乙酸为目标产物的组配， 选取S1.2中的Z2与S2.1中的F3或F4进行组配： Z2+ F3、 Z2+F4； S3.1.3以乳酸、 乙酸 为目标产物的组配： 选取S1.2中的Z1、 Z2和Z3与S2.1中的F1、 F2、 F3和F4中的两种进行组配： Z1+Z2、 Z1+Z3、 Z1+F3、 Z1+ F4、 Z2+Z3、 Z2+  F3、 Z2+ F4、 Z3+ F1、 Z3+ F2、 Z3+ F3、 Z3+ F4、 F1+F3、 F1+F4、 F2+ F3、 F2+F4、 F3+F4； 选取S1.2中的Z1、 Z2和Z3与S2.1中的F1、 F2、 F3和F4中的三种进行组配： Z1+Z2+Z3、 Z2+   F1+ F2、 Z2+ F1+ F3、 Z2+ F1+ F4、 Z3+ F1+ F2、 Z3+ F1+ F3、 Z3+ F3+ F4； 选取S1.2中的Z1、 Z2和Z3与S2.1中的F1、 F2、 F3和F4中的四种进行组配： Z1+Z2+Z3+F1、权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115466704 A 2Z1+Z2+Z3+F2、 Z1+Z2+Z3+F3、 Z1+Z2+Z3+F4； S3.2将S3.1组配的菌系之间以体积比为1:5~5:1的比例进行组配； S3.3将S3.2组配 的菌系加入含固率8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d~20d， 筛选 出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌群， 检测组配菌系的产酸潜力， 产乳酸产量大于等于6g/L、 单产乙酸产量大于等于2g/L、 乳酸、 乙酸协同生产总产量大于等 于8g/L的菌群为组配成功的高效产酸复合菌系； S3.4将S3.3中组配 成功的高效产酸复合菌系再次统一浓度1010cfu/mL进行以体积比为 1:5~5:1进行组配， 在秸秆厌氧发酵体系中进行15~20d培养后， 得到所需 高效产酸菌系。 2.根据权利要求1所述的一种未灭菌条件构建产乳酸 ‑乙酸微生物菌群方法， 其特征在 于： 在S1.1中， 所述 改良的选择性培养基组成的成分为： 胰蛋白胨10  g、 酵母粉  5g、 葡萄糖   20g 、 柠檬酸二铵  2 g、 吐温80  1.0ml、 氯化钠  25g、 磷酸二氢钾  6g、 7‑水硫酸镁  0.58 g、 7‑水硫酸铁  0.03g、 4 ‑水硫酸锰  0.15g、 蒸馏水1000ml， 配置好的培养基pH为5.3， 采用 0.5mol/L的氢氧化钠将培 养基pH调节为7.0， 显著体现复合菌系产酸对体系pH值的影响。 3.根据权利要求1所述的一种未灭菌条件构建产乳酸 ‑乙酸微生物菌群方法， 其特征在 于： 在S2.1中， 所述优化的MRS培养基组成 的成分为： 蛋 白胨10g、 牛肉粉5g、 酵母粉4g、 葡萄 糖2g、 吐温80  1.0ml、 磷酸氢二钾2g、 氯化钠5g、 柠檬酸三铵2g、 硫酸镁0.2g、 硫酸锰0.05g、 蒸馏水10 00ml。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115466704 A 3