(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211398321.2 (22)申请日 2022.11.09 (71)申请人 淮北师范大学 地址 235000 安徽省淮北市东 山路100号 (72)发明人 曾昕　朱洺志　苏志伟　曾化伟　 信丙越　赵德印　李珊珊　 (74)专利代理 机构 安徽省合肥新 安专利代理有 限责任公司 34101 专利代理师 乔恒婷 (51)Int.Cl. C12P 19/62(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/465(2006.01) C12R 1/47(2006.01) C12R 1/545(2006.01) (54)发明名称 一种基于链霉菌混菌发酵合成纳他霉素的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于链霉菌混菌发酵合 成纳他霉素的方法， 是以褐黄孢链霉菌为纳他霉 素生产菌， 以其他链霉菌为诱导菌， 两者在同一 培养基、 同一发酵条件下进行共培养菌合成纳他 霉素， 以提高纳他霉素发酵产量。 本工艺的特点 在于筛选能够促进纳他霉素合成的其他链霉菌 诱导菌种、 构建适用于两种微生物共生并提升纳 他霉素合 成水平的培养体系， 并动态调节过程中 的关键发酵参数， 实现 “链霉菌共生， 产物持续高 产”的目标。 本方法不仅可 以显著提高纳他霉素 发酵产量， 还可大幅减少培养其他微生物细胞、 提取诱导子、 处理相关废水、 诱导物精密流加控 制所需成本， 在纳他霉素生物工业化生产中具有 重要的应用价 值。 权利要求书1页 说明书5页 CN 115505615 A 2022.12.23 CN 115505615 A 1.一种基于链霉菌混菌发酵合成纳他霉素的方法， 其特 征在于： 以褐黄孢链霉菌为纳他霉素生产菌， 以其他链霉菌为诱导菌， 两者在同一培养基、 同一 发酵条件下进行共培 养菌合成纳他霉素， 以提高纳他霉素发酵产量； 所述其他链霉菌为小白链霉菌IFO14147、 灰色链霉菌CICC11002、 细黄链霉菌 CICC11041、 天蓝 淡红链霉菌 CICC11043、 广盐链霉菌 CICC11032中的一种或多种。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于： 所述其他链霉菌为小白链霉菌IFO14147。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特 征在于： 所述褐黄孢 链霉菌为褐黄孢 链霉菌ATC C 13326。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于包括如下步骤： 步骤1： 链霉菌 菌种活化 分别将不同链霉菌的孢子涂布于固体贝塔纳培养基上， 在恒温培养箱中28℃恒温培养 10d， 待孢子生长成熟。 所述 不同链霉菌包括褐黄孢 链霉菌、 其 他链霉菌 。 步骤2： 纳他霉素发酵种子 培养 刮取2‑3环褐黄孢链霉菌孢子接种于60mL液体种子培养基中， 在28℃的条件下于恒温 震荡培养箱中20 0rpm培养2d； 刮取2‑3环其他链霉菌孢子接种于80mL纳他霉素发酵培养基中， 在30℃的条件下于恒 温震荡培 养箱中20 0rpm培养1‑3d； 步骤3： 5L发酵 罐补料分批发酵 选择5L液体发酵罐， 配制纳他霉素发酵培养基于121℃灭菌20min， 总装液量设置为3L， 以8％的接种量接入步骤2获得的褐黄孢链霉菌发酵种子液， 于初始pH6.0 ‑7.5、 温度25 ‑33 ℃、 溶氧20％ ‑40％条件 下发酵； 于发酵0h ‑60h接入步骤2获得的其他链霉菌发酵种子液， 此 后用预灭菌的NaOH控制pH6.0 ‑7.5直至发酵结束； 当葡萄糖浓度低于10g/L时， 通过蠕动泵 补入葡萄糖溶液将发酵液中的葡萄糖浓度维持在10 ‑20g/L， 当纳他霉素浓度不再提高时结 束发酵。 5.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于： 步骤3中， 其 他链霉菌发酵种子液的接种量 为10％‑25％。 6.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于： 步骤3中， 于发酵45 h‑50h接入步骤2获得的其 他链霉菌发酵种子液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115505615 A 2一种基于链 霉菌混菌发酵 合成纳他霉素的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种通过对两种链霉菌进行共培养使其高效合成纳他霉素的方法， 具 体地说是筛选能促进褐黄孢链霉菌合成纳他霉素的链霉菌属微生物， 将其与褐黄孢链霉菌 置于同一生物反应器中， 以同样营养、 培养条件完成共培养， 并采用适合的过程调控方案使 得两种微生物能同时存活， 各自发挥相应作用， 最终实现高效合成纳他霉素的生产目的， 属 于工业生物技术领域。 背景技术 [0002]纳他霉素(Natamycin)是一种由链霉菌属微生物(如恰塔努加链霉菌、 褐黄孢链霉 菌、 利迪链霉菌和纳塔尔链霉菌等)通过液态深层发酵合 成的多烯大环内酯 类抗真菌剂 。 纳 他霉素能与真菌细胞膜上 的甾醇结合以破坏膜结构， 导致细胞质发生渗透， 进而强效抑制 真菌、 真菌孢子萌发以及真菌毒素生成。 纳他霉素难溶于水及油脂， 故难以进入人体内环 境， 因此显示出较高的安全性， 进而被广泛用于食品防腐保鲜及抗真菌治疗方面。 当前， 纳 他霉素的发酵水平较低， 这直接推高了售价(￥850/kg)， 也一定程度的 限制了其应用推广。 因此， 本领域研究者 一直在寻求更为高效的纳他霉素发酵合成技 术。 [0003]目前纳他霉素生物合成方面的研究大多集中在培养基优化、 培养条件优化等方 面， 然而， 对于 “微生物为什么要合成纳他霉素 ”这一根本问题研究 的较少。 本领域前期研究 发现， 部分真菌能够分泌 可促进纳他霉素合成的生物诱导子。 河南科技大学科研团队发现， Aspergillus  nigerAS 3.6472和Penicillium  chrysogenum  AS 3.5163能够产生促进纳他 霉素合成的生物诱导子， 将其发酵上清液加入到纳他霉素发酵体系中能将产量从0.63g/L 提高至2.01g/L； 安泰生物工程股份有限公司梁恒宇团队发现米黑根霉菌体的提取物也能 够促进纳他霉素合成， 其将黑根霉菌体进 行酶解， 并将酶解液加入纳他霉素发酵体系中， 实 现了25％ ‑30％的产量提升。 然而， 发明人分析发现， 以上诱导物带来的促进效果只表现在 添加后的有限时段内， 无法保持持续的诱导效应。 真菌发酵上清液/菌体提取液中的有效信 号分子在纳他霉素发酵中不够稳定， 极有可能会被纳他霉素产生菌降解。 而其中大规模的 诱导物提取、 生产过程中诱 导物的精密流加操作无疑将大 大增加原材料及人工成本 。 [0004]鉴于对此问题的思考， 江南大学史强团队试图将真菌(酿酒酵母)和链霉菌进行共 培养发酵合成纳他霉素， 以求通过真菌原 位合成诱导子来 持续促进产 物合成。 然而， 由于纳 他霉素的抗真菌特性， 发酵过程中酿酒酵母被不断杀死， 最终无法取得有益的效果。 “纳他 霉素反向抑制可产生诱导子的真菌 ”这一问题使得真菌 ‑链霉菌共培养体系在纳他霉素生 产中无法获得实现。 发明内容 [0005]为了保持生物诱导子在发酵过程中持续发挥作用， 提高纳他霉素合成水平， 本发 明提供了一种基于链霉菌混菌发酵合成纳他霉素的方法。 [0006]发明人通过大量实验研究探明， 除了真菌能够产生促进纳他霉素合成的诱导子以说　明　书 1/5 页 3 CN 115505615 A 3