(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211417029.0 (22)申请日 2022.11.14 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO:M 202 21066 2022.07.08 (71)申请人 中国远大集团有限责任公司 地址 100101 北京市朝阳区慧忠路5号远大 中心 申请人 湖北美琪健康科技有限公司 (72)发明人 陈辅辰　张恒　叶世豪　陈誉民　 邹乐　 (74)专利代理 机构 北京领科知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 11690 专利代理师 张丹　杨晞 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01)C12P 17/18(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种脱氮生丝微菌及其发酵制备吡咯喹啉 醌的方法 (57)摘要 本发明提供了一种脱氮生丝微菌MQ004 ‑2 （Hyphomicrobium  denitrificns  MQ004‑2） ， 保 藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO:M 20221066， 保藏日期为2022年7月8 号。 解决了PQQ发酵产量不高， 脱氮生丝微菌本身 代谢过程不稳定， 从而导致难以实现规模化生产 的问题。 本发明提供的菌种效价水平高； 使用本 发明提供的菌种， 批次间的效价水平稳定、 甲醇 消耗量差距小， 菌株代谢的稳定性好， 容易规模 化生产。 权利要求书1页 说明书6页 CN 115449499 A 2022.12.09 CN 115449499 A 1.一种脱氮生丝微菌MQ004 ‑2 （Hyphomicrobium  denitrificns  MQ004‑2） ， 保藏于中国 典型培养物保藏中心， 保藏编号 为CCTCC NO: M 20221066， 保藏日期为202 2年7月8号。 2.一种如权利要求1所述脱氮生丝微菌的用途， 其特 征在于： 用于制备吡咯喹啉醌； 或者， 用于制备含吡咯喹啉醌的人药、 兽药、 保健品、 食品、 饮品、 化妆品、 添加剂、 饲料中的一个或多个。 3.一种含有如权利要求1所述脱氮生丝微菌的发酵 液。 4.一种如权利要求3所述发酵 液的用途， 其特 征在于： 用于制备吡咯喹啉醌； 或者， 用于制备含吡咯喹啉醌的人药、 兽药、 保健品、 食品、 饮品、 化妆品、 添加剂、 饲料中的一个或多个。 5.一种用如权利要求1所述脱氮生丝微菌生产吡咯喹啉醌的发酵 方法。 6.如权利要求5所述的发酵 方法， 其特 征在于： 包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培 养基里， 进行发酵。 7.如权利要求6所述的发酵 方法， 其特 征在于： 所述可同化的碳源为甲醇， 或者甲胺， 或者除了甲醇外还包括其它碳源， 其它碳源至少 选自甲胺、 乙醇、 甘油、 甲酸、 乙酸、 甘露醇、 淀粉、 麦芽糊 精、 葡萄糖、 蔗糖、 乳糖、 麦芽糖、 工 业糖蜜、 豆油、 山梨醇之一或者任意几种的组合。 8.如权利要求6所述的发酵 方法， 其特 征在于： 所述可同化的氮源至少选自酵母抽提粉、 酵母粉、 酵母膏、 大豆卵磷脂、 黄豆饼粉、 棉籽 饼粉、 花生饼粉、 麸质粉、 玉米浆干粉、 豆粕、 蛋白胨、 尿素、 铵盐、 硝酸盐之一或者任意几种 的组合。 9.如权利要求6所述的发酵 方法， 其特 征在于： 所述发酵培养基还包括无机盐， 所述无机盐至少选自柠檬酸三钠、 磷酸二氢钾、 磷酸氢 二钾、 硫酸铵、 碳酸钙、 硫酸亚铁、 硫酸锌、 硫酸铜、 氯化钠、 氯化钾、 氯化钙、 硫酸镁、 氯化铁、 硫酸锰之一或任意几种的组合。 10.如权利要求5~9任意一项所述的发酵 方法， 其特 征在于： 发酵过程中包括甲醇补加控制。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115449499 A 2一种脱氮生丝微菌及其发酵制备吡咯喹啉 醌的方法 技术领域 [0001]本发明涉及 微生物技术领域， 具体涉及一种脱氮生丝微菌及其发酵制备吡咯喹啉 醌的方法。 背景技术 [0002]吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone， PQQ)是一种不同于烟酰胺核苷酸(NAD十 和NADP+)和黄素核苷酸(FAD和FMN)  的新有机氧化还原辅酶,迄今为止， PQQ催化氧化还原 反应的能力远超过已知的生物活性分子。 PQQ目前合成的方法分为化学合成法和生物合成 法两种， 生物合成法具有天然、 环保、 成本低廉、 工艺步骤少、 分离更为容易、 成品不含有毒 有害杂质的特点。 目前为止， 仅发现微生物具有合成PQQ的能力， 且广泛存在于革兰氏阴性 菌中。 甲基营养菌是以甲醇等一碳甲基化合物 （甲烷除外） 为唯一碳源的革兰氏阴性菌， 需 要通过甲醇脱 氢酶将甲醇氧化为甲醛， 然后同化为亚甲基四氢叶酸进入丝氨酸循环。 因此， 甲基营养菌必须合 成PQQ以激活甲醇脱 氢酶的活性， 满足自身正常的生理代谢需求。 甲基营 养菌在生长过程中能够合成大量的PQQ， 主要是由于其是以甲醇或甲胺等一碳化合物作为 唯一碳源和能源进行生长， 作为一碳化合物脱氢酶的辅因子PQQ必须在生长代谢过程中随 脱氢酶的生成而大量诱导合 成。 生丝微菌属于甲基营养菌， 其不能利用甲烷， 但可以利用甲 醇等其他的一碳化合物进行生长 。 [0003]现有技术中， 已经公开了多种方式来提高生丝微菌 发酵PQQ的产量。 在20 15年申请 的CN106282044A公开了一种诱变后得到的菌株， 其在80m3的发酵罐中的效价为1783mg/L， 属于目前菌种中效价高的水平， 但是该菌株的发酵体积从15m3罐上的发酵放 大到80m3罐时， 累计补入甲醇分别是20％和27%， 批次间的甲醇消耗差异大， 不利于调控发酵过程。 2016年 申请的CN 105624084A公开了一种定向驯化脱氮 生丝微菌的方法， 其得到的菌株最高不超过 23 mg/L。 2017年申请的CN107384984A公开一种特殊的培养基， 将效价从0.57g/L提高到 1.3g/L。 2 018年申请的CN108949846A公开了一种通过高密度发酵将效价从0.5 ‑1.0g/L提高 到2.0‑2.5g/L。 2019年申请的CN110195032A其公开的菌种效价为870  mg/L。 2020年申请的 CN112375792A公开了一种特殊的发酵工艺将效价从32 0.5 μg/mL提高到340.5 μg/mL。 2 021年 申请的CN113699194A公开了通过氧化还原电位控制将效价从1420.29mg/L提高到 2070.41mg/L。 由此可见， 在现有技术中， 一般通过加入特殊的培养基或改善发酵方法来改 善脱氮生丝微菌的发酵水平， 而具有高效价的诱变菌种却鲜有报道。 另外， PQQ是脱氮生丝 微菌代谢过程的副产 物， 其主要作用是激活甲醇脱 氢酶的活性， 将甲醇氧化为甲醛， 而甲醇 虽然是脱氮生丝微菌的碳源和能源， 但过高的甲醇浓度会对其细胞造成损伤直至死亡。 因 此如何提升脱氮生丝微菌本身产PQQ的能力 （尤其是需求甲醇更少、 产量更高的菌株） 是一 个巨大的挑战。 [0004]基于现有技术的情况， 在工业化放大生产中， 除了需要提升菌种本身的效价， 如何 有效降低成本和方便调控发酵也是急需克服的主 要问题。说　明　书 1/6 页 3 CN 115449499 A 3