(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210000361.0 (22)申请日 2022.01.03 (71)申请人 海南师范大学 地址 571158 海南省海口市琼 山区龙昆南 路99号海南师 范大学 (72)发明人 孙伟　闫丽君　艾益静　张婧媱　 张思月　童菀玥　 (51)Int.Cl. G01N 27/327(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种纳米金-石墨炔复合材料修饰电极测定 大肠杆菌 基因序列 (57)摘要 本发明为一种纳米金 ‑石墨炔复合材料修饰 电极测定 大肠杆菌基因序列， 以离子液体修饰碳 糊电极 （CILE） 作为基底电极， 通过滴涂法和恒电 位沉积法两步制备了纳米金 （Au） ‑石墨炔 （GDY） 复合材料修饰电极， 并将其作为工作电极。 扫描 电镜 （SEM） 观察了GDY及其Au ‑GDY复合材料微观 尺寸的形貌。 循环伏安法 （CV） 结果表明， Au ‑GDY 复合材料有效地改善了修饰电极界面的电化学 性能， 提高了电极的电子传递速率。 利用金硫的 自组装键合作用， 成功将巯基修饰的探针ssDNA 固定到修饰电极表面。 以亚甲基蓝 （MB） 作为电化 学指示剂， 用于对目标序列成功捕获的信号判 断。 示差脉冲伏安法 （DPV） 结果表明， 该Au ‑GDY/ CILE修饰电极对大肠杆菌的基因序列检测具有 宽的检测范围 （1.0 ×10‑15 mol/L~1.0×10‑7  mol/L） 、 低的检测限 （3.17 ×10‑16 mol/L） 及高的 灵敏度 （2.91 µA/(M·cm2)） 。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114280127 A 2022.04.05 CN 114280127 A 1.一种Au ‑GDY纳米复合材料修饰电极测定大肠杆菌基因序列， 其特征在于， 按以下步 骤： GDY修饰电极的制备： 将GDY溶液滴涂在CILE基底电极表面， 室温晾干， 得到GDY/CILE修 饰电极。 2.Au/GDY/CILE修饰电极的制备： 将步骤 （1） 所制备的GDY/CILE修饰电极置于HAuCl4溶 液中进行恒电位 沉积， 然后洗涤电极自然晾干， 即制得Au/GDY /CILE修饰电极。 3.探针ssDNA序列的固定及与目标ssDNA的杂交： 将巯基修饰的探针ssDNA序列 （S ‑ ssDNA） 滴涂于Au/GDY/CILE修饰电极表面， 自组装固定， 用超纯水轻轻冲洗电极， 待干燥后 得到ssDNA ‑S‑Au/GDY/CILE， 表面继续滴加目标ssDNA序列后在室温杂交， 超纯水洗涤除去 未杂交的目标序列， 干燥后即得到dsDNA ‑S‑Au/GDY/CILE。 4.根据权利要求1所述的Au ‑GDY修饰电极制备， 其特征在于， 步骤1中所使用的GDY溶液 浓度为1.0  mg/mL， 用量为8  μL； HAuCl4溶液的浓度为1.6  mg/mL， 沉积电位为 ‑0.6 V~‑0.2  V （vs. Ag/AgCl） ， 沉积时间为10  s~200 s。 5.根据权利 要求1的探针ssDNA序列的固定及与目标ssDNA的杂交， 其特征在于步骤 （3） 中探针SH ‑ssDNA序列的浓度为1.0 ×10‑7 mol/L， 用量为10  μL； 目标ssDNA的浓度为1.0 × 10‑15 mol/L~1.0×10‑7 mol/L， 用量 为10 μL。 6.根据权利要求3所构建的方法， 其特征在于使用亚甲基蓝 （MB） 作为电化学指示剂； 示 差脉冲伏安法 （D PV） 检测修饰电极表面的电化学信号响应。 7.根据权利要求 4所述的D PV技术， 电解质溶 液为50.0 mmol/L pH 7.0 PBS。 8.根据权利要求4或5所构建的方法， 其特征在于MB的工作浓度为5.0 ×10‑5 mol/L~3.0 ×10‑4 mol/L， 吸附时间为2  min~8 min。 9.根据权利 要求1‑6所述的Au ‑GDY纳米复合材料修饰电极用于对大肠杆菌基因序列检 测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114280127 A 2一种纳米金 ‑石墨炔复合材料修饰电极测定大肠杆菌基因 序列 技术领域 [0001]本发明属于电极材料技术领域， 涉及一种纳米金 ‑石墨炔复合材料及其制 备方法 和对大肠杆菌基因序列的检测。 背景技术 [0002]食源性疾病是人类健康面临的最大挑战之一， 其大量发生不仅会给人们的生命安 全造成严重威胁， 还会带来巨大 的经济损失。 食源性致病菌是导致许多严重的食源性疾病 爆发的重要原因。 大肠杆菌就是主要食源性致病菌的一种。 大肠杆菌致病途径主要是消 化 道传播， 通过食用受污染的食物或水源摄入体内而致病， 导致尿道感染、 腹膜炎、 胆囊炎、 阑 尾炎甚至菌血症 等疾病。 传统检测大肠杆菌的方法有多 管发酵法、 纸片快速 法、 PCR检测法、 免疫学抗体检测法等； 新型检测方法有环介导等温扩增反应发、 微流控芯片、 生物传感器技 术等。 其中电化学传感技术由于操作简单、 快速、 低成本、 灵敏等优点， 已经成为最广泛的微 生物检测技 术之一。 [0003]尽管电化学传感技术取得了很多的进步， 但设计新型功能化的材料以提高传感技 术的灵敏度、 提升其对目标分析物的准确捕获， 依旧是研究人员的众挑战之一。 石墨炔 （GDY） 的成功制备， 得到了不同领域科研工作者的广泛关注并迅速发展成为新研究领域和 热点。 石墨炔是由sp杂化的1,3 ‑二炔键合sp2杂化的苯环直接连接形成的二 维平面结构， 具 有丰富的碳化学键、 大共轭体系、 较多的活性位点、 优良的化学稳定性、 可控的杂原子掺杂。 作为一种新型的碳材料， 石墨炔具有独特的孔洞结构和电子结构。 因此， 石墨炔在具有二 维 平面的同时， 还具有三维多孔材料的特征， 使其在光电、 电子、 能源及催化等领域具有重要 的潜在应用价 值。 发明内容 [0004]本发明提供了一种Au ‑GDY纳米复合材料修饰电极， 所述Au ‑GDY纳米复合材料具有 大的比表 面积和高导电性； Au ‑GDY纳米复合材料修饰电极对大肠杆菌基因序列的检测具有 较高的灵敏度和 较宽的检测范围。 另外该修饰电极制备工艺简单、 特异性好、 成本低廉、 适 用性好、 便于推广使用。 本发明提供了上述技术方案所述Au ‑GDY纳米复合材料修饰电极测 定大肠杆菌基因序列， 包括以下步骤： （1） GDY修饰电极的制备： 将GDY溶液滴涂在CILE基底 电极表面， 室温晾干， 得到GDY/CILE修饰电极； （2） Au/GDY/CILE修饰电极的制备： 将步骤 （1） 所制备的GDY/CILE修饰电极置于HAuCl4溶液中进行恒电位沉积， 然后洗涤电极自然晾干， 即制得Au/GDY/CILE修饰电极； （3） 探针ssDNA序列的固定及与目标ssDNA的杂交： 将巯基修 饰的探针ssDNA序列 （S ‑ssDNA） 滴涂于Au/GDY/CILE修饰电极表面， 自组装固定， 用超纯水轻 轻冲洗电极， 待干燥后得到ssDNA ‑S‑Au/GDY/CILE， 表面继续滴加目标ssDNA序列后在室温 杂交， 超纯 水洗涤除去未杂交的目标序列， 干燥后即得到dsDNA ‑S‑Au/GDY/CILE。 [0005]优选地， 所使用的GDY浓度为1.0  mg/mL， 用量为8  μL； HAuCl4溶液的浓度为1.6  说　明　书 1/4 页 3 CN 114280127 A 3