(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210001324.1 (22)申请日 2022.01.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430000 湖北省武汉市武汉经济技 术 开发区三角湖路8号江汉大 学 (72)发明人 彭海　陈利红　李甜甜　李论　 万人静　肖华锋　周俊飞　方治伟　 高利芬　 (74)专利代理 机构 河南豫龙律师事务所 41 177 代理人 游国战 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测油菜转基因品系的引物对组合、 试 剂盒、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测油菜转基因品系的引物对组合、 试剂盒、 检测 方法及应用法。 所述的检测油菜转基因品系的引 物对组合包括以扩增12种常用油菜转基因品系 特异性序列设计得到的引物组以及1种以油菜内 参基因PE3 ‑PEPCase序列设计得到的2对引物对。 本发明还涉及检测油菜转基因品系的试剂盒及 检测方法。 本发明技术方案操作简单， 检测效率 高； 检验对象全面， 具有较高的检测特异性、 准确 度和灵敏性； 可用于转基因油菜及其制品的大规 模检测， 具有较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 CN 114107552 A 2022.03.01 CN 114107552 A 1.一种检测油菜转基因品系的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合包括编号为 BnGMO1、 BnGMO2、 BnGMO3、 BnGMO4、 BnGMO5、 BnGMO6、 BnGMO7、 BnGMO8、 BnGMO9、 BnGMO10、 BnGMO11、 BnGMO12的12对引物， 每对引物由正向引物和反向引物组成， 具体的引物对组合核 苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.24所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增油 菜内参基因PE3 ‑PEPCase的编号为BnGMO13、 BnGMO14两对引物对组合， 每对引物由正向引物 和反向引物组成， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.25‑SEQ ID NO.28所示。 3.一种检测油菜转基因品系的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1所述的 检测油菜转基因品系的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增油菜内参基因PE3 ‑ PEPCase的引物对组合。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括多重PCR预 混液。 5.权利要求1或2所述的引物对组合、 权利要求3或4的述的检测试剂 盒在检测转基因油 菜及相关产品中的应用。 6.一种检测油菜转基因品系的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)以油菜转基因品系的特 征核苷酸序列和油菜内参基因进行参 考， 得到多重PCR引物； 2)得到待测油菜的DNA； 以所述DNA为模板， 将所述多重PCR引 物加入反应体系中， 进行 扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通量测序， 得到高通量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 以实现检测油菜转基因品系。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述扩增反应的环境/程序包括： 94℃ 预变 性5分钟； 第一步扩增反应， 94℃变性15s， 62℃～ 56℃退火30s， 12个T ouch Down cycle， (每 个循环退火及延伸的温度降低0.5℃)； 第二步扩增反应， 94℃变性15s， 57℃退火30S， 22个 cycle。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 反应体系包括： 总体系40μl， 引物预混液 2.5 μl、 2×buffer： 20 μl， 多重PCR扩增酶： 0.5 μl； 其余的用水补充； 剩余的用水补充； 所述高 通量文库的浓度大于2ng/ul 为合格。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107552 A 2一种检测油菜转基因 品系的引物对组合、 试剂盒、 检测方 法及 应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种检测油菜转基因品系的引物对组  合、 试 剂盒、 检测方法及应用。 背景技术 [0002]转基因油菜是全球四大转基因作物之一， 其种植面积占全球转基因作物的   5.3％。 油菜在我国有很大的种植面积， 是我国重要的由来作 物。 由于转基因油  菜在我国还 没有商业化种植， 为了满足食用油和菜粕的用量， 我国每年需要进  口大量的油菜籽用作加 工原料。 然而 大量的转基因产涌入市场， 其环 境及安全  问题开始引起人们的重视， 因此， 开 发高效、 便捷的转基因食品检测技 术显得 至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测  方法。 目前基于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技  术， 其主要包括普 通定性PCR、 巢式PCR、 环介导等 温扩增技术(LAMP)、 荧光  定量PCR多重PCR等方法。 相对于普 通定性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵  敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性强， 然而引物设计较为复杂，  容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复 性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通  的多 重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因， 但 一般不超过6重， 否  则引物之间干扰较 大， 影响检测效果。 基因芯片和数字P CR技术也是常用的转  基因产品检测技术， 它们均具有 高通量、 灵敏度高、 特异 性强等优点， 且 可平 行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测 多种转基因作物； 然而其成本高  昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业 素质， 这些因素限制  了该技术在检测中的广泛应用。 [0004]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决  的关键 问题。 发明内容 [0005]本发提供了一种面检测油菜转基因品系的引物对组合、 试剂盒及检测方  法， 以解 决基于定量PCR技 术通量低、 基因芯片和数字PCR技 术的转基因检测  成本高的技 术问题。 [0006]本发提供的一种面检测油菜转基因品系的技术方案， 以12种检测常用的  油菜转 基因品系OXY ‑235、 T45、 MS1(B91 ‑4)、 RT73(GT73)a、 RT73(GT73)b、  MON88302、 Rf1、 Rf2、 Rf3、 Topas19、 MS8、 DP ‑073496‑4的特异性核苷酸序列  即本发明所筛选的靶标分子， 以及内参基 因PE3‑PEPCase作为检测目标， 设计  多重PCR扩增引物对的核苷酸序列； 开发了13对引物， 所述引物互相间不影  响， 可以通过多重P CR进行高效的扩增。 所述多重P CR引物组合可以用 于开发 油菜转基因品系检测试剂盒。 [0007]具体的技术方案为， 第一方面， 本申请提供了一种检测油菜转基因品系引  物对组 合， 即包括编号为BnGMO1、 BnGMO2、 BnGMO3、 BnGMO4、 BnGMO5、 BnGMO6、  BnGMO7、 BnGMO8、说　明　书 1/7 页 3 CN 114107552 A 3