(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210001372.0 (22)申请日 2022.01.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430000 湖北省武汉市武汉经济技 术 开发区三角湖路8号江汉大 学 (72)发明人 陈利红　彭海　方治伟　李论　 周俊飞　高利芬　李甜甜　肖华锋　 万人静　 (74)专利代理 机构 河南豫龙律师事务所 41 177 代理人 游国战 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测马铃薯转基因成分和转基因品系 的引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测马铃薯转基因成分和转基因品系的引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用。 所述的检测马铃薯常 用的转基因元件及转基因品系的引物对组合包 括以扩增15种常用马铃薯转基因元件、 2种转基 因品系特异性序列以及1种马铃薯内参基因ST ‑ LS1(light ‑inducible tissue‑specific gene) 的引物组。 本发明还涉及检测马铃薯转基因元 件、 转基因品系的试剂盒与检测方法。 本发明技 术方案操作简单， 检测效率高； 检验对象全面， 具 有较高的检测特异性、 准确度和灵敏性； 可用于 转基因马铃薯及其制品的大规模检测， 具有较好 的应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 序列表7页 附图1页 CN 114369675 A 2022.04.19 CN 114369675 A 1.一种检测马铃薯转基因元件及转基因品系的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对 组合包括编号为StGMO1、 StGMO2、 StGMO3、 StGMO4、 StGMO5、 StGMO6、 StGMO7、 StGMO8、 StGMO9、 StGMO10、 StGMO11、 StGMO12、 StGMO13、 StGMO14、 StGMO15、 StGMO16、 StGMO17、 StGMO18、 StGMO19的19对引物， 每对引物由正向引物和反向引物组成， 具体的引物对组合核苷 酸序列 如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.38所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增马 铃薯内参基因ST ‑LS1的编号为StGMO21、 StGMO22两对引物对组合， 每对引物由正向引物和 反向引物组成， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.39‑SEQ ID NO.42所示。 3.一种检测马铃薯转基因元件和转基因品系的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 权利要求1所述的检测马铃薯转基因元件和转基因品系的引物对组合和权利要求2所述的 用于扩增马铃薯内参基因ST ‑LS1的引物对组合。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括多重PCR预 混液。 5.权利要求1或2所述的引物对组合、 权利要求3或4的述的检测试剂 盒在检测转基因马 铃薯及相关产品中的应用。 6.一种检测马铃薯转基因品系的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)以马铃薯转基因元件、 转基因品系的特征核苷酸序列和马铃薯内参基因进行参考， 得到多重PCR引物； 2)得到待测马铃薯的DNA； 以所述DNA为模板， 将所述多重PCR引 物加入反应体系中， 进 行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通量测序， 得到高通量文库； 将所述高 通量文库中的基因序列进行分析， 以实现检测马铃薯常见转基因元件及转基因品系。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述扩增反应的环境/程序包括： 94℃ 预变 性5分钟； 第一步扩增反应， 94℃变性15s， 62℃～ 56℃退火30s， 12个T ouch Down cycle， (每 个循环退火及延伸的温度降低0.5℃)； 第二步扩增反应， 94℃变性15s， 57℃退火30S， 22个 cycle。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 反应体系包括： 总体系40μl， 引物预混液 2.5 μl、 2×buffer： 20 μl， 多重PCR扩增酶： 0.5 μl； 其余的用水补充； 剩余的用水补充； 所述高 通量文库的浓度大于2ng/ul 为合格。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369675 A 2一种检测马铃薯转基因成分和转基因 品系的引物组合、 试剂 盒、 检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 特别涉及一种检测马铃薯转基 因成分和转基 因品系的 引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用。 背景技术 [0002]马铃薯是仅次于水稻,玉米,小麦的世界第四大食用作物。 马铃薯作为世界上重要 的农作物之一,具有较高的经济价值,在国际农产品贸易中占有举足轻重的地位。 目前,全 球共批准商业化种植的转基因马铃薯40余种,主要性状为： 抗病,抗虫和品质改良等,欧盟 已经批准转基因马铃薯的生产和使用， 其中部分产品即将在我国申请转基因生物安全证 书。 随着大量的转基因马铃薯被直接或间接地制成食品以及国际社会对转基因产品安全性 问题的日益关注， 农产品中的转基因成分检测已纳 入国内外检验检疫部门的检测项目并逐 渐得到加强。 因此， 开发高效、 便捷的转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 目 前基于核酸的P CR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通定 性PCR、 巢式PCR、 环介导等温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相对于普通定 性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性 强， 然而引 物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通的多重P CR方法 可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过6重， 否则引物之间干扰较大， 影响检 测效果。 基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通量、 灵 敏度高、 特异性 强等优点， 且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因 作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些因 素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0004]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决的关键 问题。 发明内容 [0005]本发提供了一种面检测马铃薯转基因元件、 品系的引 物对组合、 试剂盒及检测方 法， 以解决基于定量PCR技术通量低、 基因芯片和数字PCR技术的转基因检测成本高的技术 问题。 [0006]本发提供的一种面检测 马铃薯转基因元件及品系的技术方案， 以15种检测常用的 马铃薯转基因元件p35S、 t35S、 pNOS、 pFMV35S、 tNOS、 PAT、 bar、  NPtII、 Hpt、 cp4epsps、 E93、 pVYCP、 RLRV、 pSSuAra、 CryIII a和3个转基因品系EH92 ‑527‑1、 RH149N09、 AV43 ‑6‑G7的特异 性核苷酸序列即本发明所筛选的靶标分子， 以及内参基因ST ‑LS1作为检测目标， 设计多重 PCR扩增引物对的核苷 酸序列； 开发了21对引物， 所述引物互相间不影响， 可以通过多重PCR  说　明　书 1/8 页 3 CN 114369675 A 3