(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210001420.6 (22)申请日 2022.01.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430000 湖北省武汉市武汉经济技 术 开发区三角湖路8号江汉大 学 (72)发明人 万人静　彭海　高利芬　李甜甜　 陈利红　肖华锋　周俊飞　李论　 方治伟　 (74)专利代理 机构 河南豫龙律师事务所 41 177 代理人 游国战 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测小麦转基因成分和转基因品系的 引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测小麦转基因成分和转基因品系的引物组合、 试 剂盒、 检测方法及应用。 所述的检测小麦常用的 转基因元件及转基因品系的引物对组合包括 以 扩增9种常用小麦转基因元件、 3种转基因品系 Ta_B73‑6‑1、 Ta_B72 ‑8‑1、 Ta_B102 ‑1‑2特异性序 列以及2种小麦内参基因Ta_Waxy ‑D10和Ta_ GAG56D的引物组。 本发明还涉及检测小麦转基因 元件和品系的试剂盒与检测方法。 本发明技术方 案操作简单， 检测效率高， 检验对象全面， 具有较 高的检测特异性、 准确度和灵敏性等特点； 可用 于转基因小麦及其制品的大规模检测， 具有较好 的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图1页 CN 114369677 A 2022.04.19 CN 114369677 A 1.一种检测小麦转基因元件及转基因品系的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组 合包括编号为TaGMO1、 TaGMO2、 TaGMO3、 TaGMO4、 TaGMO5、 TaGMO6、 TaGMO7、 TaGMO8、 TaGMO9、 TaGMO10、 TaGMO11、 TaGMO12的12对引物， 每对引物由正向引物和反向引物组成， 具体的引物 对组合核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.24所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增小 麦内参基因Ta_Waxy ‑D10的编号为TaGMO13和内参基因Ta_GAG56D的编号为TaGMO14两对引 物对组合， 每对引物由正向引物和反向引物组成， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.25‑SEQ ID  NO.28所示。 3.一种检测小麦转基因元件和转基因品系的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权 利要求1所述的检测小麦转基因元件和品系的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增小 麦内参基因Ta_Waxy ‑D10、 Ta_GAG5 6D的引物对组合。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括多重PCR预 混液。 5.权利要求1或2所述的引物对组合、 权利要求3或4的述的检测试剂 盒在检测转基因小 麦及相关产品中的应用。 6.一种检测小麦转基因元件和品系的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)以小麦转基因元件和品系的特征核苷酸序列及小麦内参基因为参考， 得到多重PCR 引物； 2)得到待测小麦样品的DNA； 以所述DNA为模板， 将所述多重PCR引 物加入反应体系中， 进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通量测序， 得到高通量文库； 将所述 高通量文库中的基因序列进行分析， 以实现检测小麦常见转基因元件和品系。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述扩增反应的环境/程序包括： 94℃ 预变 性5分钟； 第一步扩增反应， 94℃变性15s， 62℃～ 56℃退火30s， 12个T ouch Down cycle， (每 个循环退火及延伸的温度降低0.5℃)； 第二步扩增反应， 94℃变性15s， 57℃退火30S， 22个 cycle。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 反应体系包括： 总体系40μl， 引物预混液 2.5 μl、 2×buffer： 20 μl， 多重PCR扩增酶： 0.5 μl； 其余的用水补充； 剩余的用水补充； 所述高 通量文库的浓度大于2ng/ul 为合格。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369677 A 2一种检测小 麦转基因成分和转基因 品系的引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种检测小麦转基因成分和转基因品  系的 引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用。 背景技术 [0002]小麦(Triticun  aestivum  L.)属于禾本科小麦属。 在世界范围内是种植  面积最 大， 总产量最高的粮食作物， 是重要的植物蛋白来源之一的粮食作物。  恶劣的气候以及病 虫害都会严重制约小麦的生产。 为了创制新品种， 导入外源  基因改良小麦性状。 自1992年 第一株转基因的小麦诞生以来， 小麦的遗传改  良得到了巨大的发展。 然而转基因技术对粮 食安全问题意 义重大。 因此， 开发  高效、 便捷的转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测  方法。 目前基于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技  术， 其主要包括普 通定性PCR、 巢式PCR、 环介导等 温扩增技术(LAMP)、 荧光  定量PCR多重PCR等方法。 相对于普 通定性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵  敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性强， 然而引物设计较为复杂，  容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复 性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通  的多 重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因， 但 一般不超过6重， 否  则引物之间干扰较 大， 影响检测效果。 基因芯片和数字P CR技术也是常用的转  基因产品检测技术， 它们均具有 高通量、 灵敏度高、 特异 性强等优点， 且 可平 行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测 多种转基因作物； 然而其成本高  昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业 素质， 这些因素限制  了该技术在检测中的广泛应用。 [0004]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决  的关键 问题。 发明内容 [0005]本发提供了一种面检测小麦转基因元件和品系的引 物对组合、 试剂盒及检  测方 法， 以解决基于定量PCR技术通量低、 基因芯片和数字P CR技术的转基因  检测成本高的技术 问题。 [0006]本发提供的一种全面检测小麦转基因元件和品系的技术方案， 以9种检测  常用的 小麦转基因元件Ubi、 pRice_actin、 Hsp、 tN OS、 aad、 GUS、 bar、 PAT、  cp4epsps和3个转基因品 系Ta_B73 ‑6‑1、 Ta_B72 ‑8‑1、 Ta_B102 ‑1‑2的特异性  核苷酸序列即本发明所筛选的靶标分 子， 以及内参基因Ta_Waxy ‑D10和 Ta_GAG56D作为检测目标， 设计多重PCR扩增引物对的核 苷酸序列； 开发了14  对引物， 所述引物互相间不影响， 可以通过多重PCR进行高效的扩增 。 所述多 重PCR引物组合可以用于开发小麦转基因元件和品系检测试剂盒。 [0007]具体的技术方案为， 第一方面， 本申请提供了一种检测小麦转基因元件和  品系引说　明　书 1/7 页 3 CN 114369677 A 3