(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210001308.2 (22)申请日 2022.01.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430000 湖北省武汉市武汉经济技 术 开发区三角湖路8号江汉大 学 (72)发明人 高利芬　彭海　陈利红　李甜甜　 周俊飞　肖华锋　方治伟　李论　 万人静　 (74)专利代理 机构 河南豫龙律师事务所 41 177 代理人 游国战 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测油菜转基因成分的引物对组合、 试 剂盒、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测油菜转基因成分的引物对组合、 试剂盒及检测 方法。 所述的检测油菜转基因成分的引物对组合 包括用以扩增22种常用的检测转基因元件以及1 种油菜内参基因序列HMGI/Y的引物对。 本发明还 涉及检测油菜转基因成分的试剂盒及检测方法。 本发明技术方案操作简单， 检测 效率高； 检验对 象全面， 具有较高的检测特异性、 准确度和灵敏 性； 可用于转基因油菜及其制品的大规模检测， 具有较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表8页 附图1页 CN 114277178 A 2022.04.05 CN 114277178 A 1.一种检测油菜转基因成分的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合包括编号为 BnGMO1、 BnGMO2、 BnGMO3、 BnGMO4、 BnGMO5、 BnGMO6、 BnGMO7、 BnGMO8、 BnGMO9、 BnGMO10、 BnGMO11、 BnGMO12、 BnGMO13、 BnGMO14、 BnGMO15、 BnGMO16、 BnGMO17、 BnGMO18、 BnGMO19、 BnGMO20、 BnGMO21、 BnGMO22的22对引物， 每对引物由正向引物和反向引物组成， 具体的引物 对组合核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.44所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增油 菜内参基因HMGI/Y的编号为BnGMO23、 BnGMO24两对引物对组合， 每对引物由正向引物和反 向引物组成， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.45‑SEQ ID NO.48所示。 3.一种检测油菜转基因成分的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1所述的 检测油菜转基因成分的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增油菜内参基因HMGI/Y的引 物对组合。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括多重PCR预 混液。 5.权利要求1或2所述的引物对组合、 权利要求3或4的述的检测试剂 盒在检测转基因油 菜及相关产品中的应用。 6.一种检测油菜转基因成分的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)以油菜转基因元件和油菜内参基因进行参 考， 得到多重PCR引物； 2)得到待测油菜的DNA； 以所述DNA为模板， 将所述多重PCR引 物加入反应体系中， 进行 扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通量测序， 得到高通量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 以实现检测油菜转基因成分。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述扩增反应的环境/程序包括： 94℃ 预变 性15分钟； 第一步扩增反应， 94℃变性20秒， 65℃～57℃退火并延伸60秒， 10个Touch  Down 循环， (每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)； 第二步扩增反应， 9 4℃变性20秒， 57℃退火 并延伸60秒， 26个 循环。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 反应体系包括： 总体系30 μl， 引物对： 2 μl、 2 ×buffer： 15ul， 多重扩增酶： 0.5 μl； 剩余的用水补充； 所述高通量文库的浓度大于2ng/ul 为合格。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114277178 A 2一种检测油菜转基因成分的引物对组合、 试剂盒、 检测方 法及 应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种检测油菜转基因成分的引 物对组合、 试 剂盒、 检测方法及应用。 背景技 术 [0002]转基因油菜是全球四大转基因作物之一， 其种植面积占全球转基因作物的5.3％。 油菜在我过有很大 的种植面积， 是我国重要的由来作物。 由于转基因油菜在我国还没有商 业化种植， 为了满足食用油和菜粕的用量， 我国每年需要进口大量的油菜籽用作加工原料。 然而大量的转基因产涌入市场， 其环境及安全问题开始引起人们的重视， 因此， 开发高效、 便捷的转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 目 前基于核酸的P CR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通定 性PCR、 巢式PCR、 环介导等温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相对于普通定 性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性 强， 然而引 物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通的多重P CR方法 可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过6重， 否则引物之间干扰较大， 影响检 测效果。 基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通量、 灵 敏度高、 特异性 强等优点， 且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因 作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些因 素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0004]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决的关键 问题。 发明内容 [0005]本申请实施例的技 术方案为 解决上述 技术问题， 总体思路如下： [0006]筛选常用的油菜转基因产品检测元件核苷酸序列即靶标分子及内参基因作为检 测目标。 包括22种检测常用的转基因元件： p35S、 t35S、 pNOS、 pFMV35S、 tNOS、 tPIN Ⅱ、 pRBCS4、 tE9、 t7s、 PAT、 bar、 NPtII、 GOX、 pTsf1、 pTA29、 Barnase、 barstar、 tOCS、 tg7、 AtRbcs ‑ transit‑peptide、 cp4epsps和pA tUbiQuittin10， 以及包括1油菜内参基因的序列H MGI/Y。 [0007]接着， 本发明开发了用于检测所述的转基因元件和油菜内参基因的多重PCR引物 组合物， 其中22对针对22种转基因元件， 2对针对两个内参基因。 所述引物互相间不冲突， 可 以通过多重P CR进行高效的扩增。 所述多重P CR引物组合物可以用于开 发转基因元件检测试 剂盒。 [0008]具体的技术方案为， 第一方面， 本申请提供了一种检测油菜转基因成分引 物对组 合， 所述的引物对组合包括编号为BnGMO1、 BnGMO2、 BnGMO3、 BnGMO4、 BnGMO5、 BnGMO6、 BnGMO7、 BnGMO8、 BnGMO9、 BnGMO10、 BnGMO11、 BnGMO12、 BnGMO13、 BnGMO14、 BnGMO15、 BnGMO16、说　明　书 1/7 页 3 CN 114277178 A 3