(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210001378.8 (22)申请日 2022.01.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430000 湖北省武汉市武汉经济技 术 开发区三角湖路8号江汉大 学 (72)发明人 李甜甜　李论　彭海　周俊飞　 肖华锋　万人静　陈利红　高利芬　 方治伟　 (74)专利代理 机构 河南豫龙律师事务所 41 177 代理人 游国战 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测烟草转基因成分的引物组合、 试剂 盒、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测烟草转基因成分的引物组合、 试剂盒、 检测方 法及应用。 所述的检测烟草转基因成分的引物对 组合包括用以扩增15种常用的检测转基因元件 以及1种烟草内参基因序列NT_UBI的引物对。 本 发明还涉及检测烟草转基因成分的试剂盒及检 测方法。 本发明技术方案操作简单， 检测效率高； 检验对象全面， 具有较高的检测特异性、 准确度 和灵敏性等特点； 可用于转基因烟草及其制品的 大规模检测， 具有较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表6页 附图1页 CN 114369676 A 2022.04.19 CN 114369676 A 1.一种检测烟草转基因成分的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合包括编号为 NtGMO1、 NtGMO2、 NtGMO3、 NtGMO4、 NtGMO5、 NtGMO6、 NtGMO7、 NtGMO8、 NtGMO9、 NtGMO10、 NtGMO11、 NtGMO12、 NtGMO13、 NtGMO14、 NtGMO15的15对引物， 每对引物由正向引物和反向引 物组成， 具体的引物对组合核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.30所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增烟 草内参基因NT_UBI的编号为NtGMO16 的一对引 物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.31‑SEQ ID  NO.32所示。 3.一种检测烟草转基因成分的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1所述的 检测烟草转基因成分的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增烟草内参基因NT_UBI的引 物对组合。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括多重PCR预 混液。 5.权利要求1或2所述的引物对组合、 权利要求3或4的述的检测试剂 盒在检测转基因烟 草种子及相关产品中的应用。 6.一种检测烟草 转基因成分的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)以烟草 转基因元件和烟草内参基因进行参 考， 得到多重PCR引物； 2)得到待测烟草的DNA； 以所述DNA为模板， 将所述多重PCR引 物加入反应体系中， 进行 扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通量测序， 得到高通量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 以实现检测烟草 转基因成分。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述扩增反应的环境/程序包括： 94℃ 预变 性15分钟； 第一步扩增反应， 94℃变性20秒， 65℃～57℃退火并延伸60秒， 10个Touch  Down 循环， (每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)； 第二步扩增反应， 9 4℃变性20秒， 57℃退火 并延伸60秒， 26个 循环。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 反应体系包括： 总体系30 μl， 引物对： 2 μl、 2 ×buffer： 15ul， 多重扩增酶： 0.5 μl； 剩余的用水补充； 所述高通量文库的浓度大于2ng/ul 为合格。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369676 A 2一种检测烟草转基因成分的引物组合、 试剂盒、 检测方 法及 应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种检测烟草转基因成分的引 物组合、 试剂 盒、 检测方法及应用。 背景技术 [0002]烟草(Nicot iana tabacum L.)属于茄科， 烟草属。 起源于大洋洲、 美洲以及南太平   洋的一些岛屿。 烟草是一种重要的经济作物， 也是世界各国的第一锐利行业， 种植面积非   常大。 如何改善烟草的品质和产量以及抗逆性是研究者关心的问题。 由于烟草易于组织培   养和转化， 通过转基因技术得到烟草植株及其后代可以改善上述问题。 但是转基因制品的   安全问题一 直是人们重视的问题。 因此， 开发高效、 便捷的转基因检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 目 前基 于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通 定性 PCR、 巢式PCR、 环介导等 温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相对于普通   定性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性强，  然 而引物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重  复性 好、 灵敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其成本高， 并且需要特殊检测 仪器。 普通  的多重 PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过六重， 否则引物之间  干扰较 大， 影响检测效果。 基因芯片和数字P CR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它  们均具有 高通量、 灵敏度高、 特异 性强等优点， 且 可平行检测1个转基因作 物中多个基因  或同时检测 多种转基因作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有  较高的专业 素质， 这些因素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0004]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决的关键 问题。 发明内容 [0005]本申请实施例的技 术方案为 解决上述 技术问题， 总体思路如下： [0006]筛选常用的烟草转基因产品检测元件核苷酸序列即靶标分子及内参基因作为检 测目 标。 包括15种检测常用的转基因元件： p35S、 t35S、 pFMV35S、 tNOS、 PAT、 bar、 NPtII、   Hpt、 cp4epsps、 E93、 TMV ‑CP、 pVY_CP、 CMV_CP、 Cry1Ab和GUS以及包 括1烟草内参基因  的序列 NT_UBI。 [0007]接着， 本发明开发了用于检测所述的转基因元件和烟草内参基因的多重PCR引物 组合 物， 其中15对针对15种转基因元件， 1对针对1个内参基因。 所述引物互相间不冲突， 可   以通过多重PCR进行高效的扩增。 所述多重PCR引物组合物可以用于开发转基因元件检测   试剂盒。 [0008]具体的技术方案为， 第一方面， 本申请提供了一种检测烟草转基因成分引 物对组说　明　书 1/7 页 3 CN 114369676 A 3