(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210014338.7 (22)申请日 2022.01.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430000 湖北省武汉市武汉经济技 术 开发区三角湖路8号江汉大 学 (72)发明人 张静　彭海　肖华锋　李论　 方治伟　陈利红　李甜甜　高利芬　 万人静　周俊飞　 (74)专利代理 机构 河南豫龙律师事务所 41 177 代理人 游国战 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测番茄转基因成分和转基因品系的 引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测番茄转基因元件和品系的引物对组合、 试剂盒 及检测方法。 所述的检测番茄常用的转基因元件 及转基因品系的引物对组合包括以扩增11种常 用番茄转基因元件、 1种转基因品系特异性序列 以及1种番茄内参基因Sl_LAT52的引物组。 本发 明还涉及检测番茄转基因元件和品系的试剂盒 与检测方法。 本发明技术方案操作简单， 检测 效 率高， 检验对象全面， 具有较高的检测特异性、 准 确度和灵敏性等特点； 可用于转基因番茄及其制 品的大规模检测， 具有较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图1页 CN 114196782 A 2022.03.18 CN 114196782 A 1.一种检测番茄转基因元件及转基因品系的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组 合包括编号为SlGMO1、 SlGMO2、 SlGMO3、 SlGMO4、 SlGMO5、 SlGMO6、 SlGMO7、 SlGMO8、 SlGMO9、 SlGMO10、 SlGMO11、 SlGMO12的12对引物， 每对引物由正向引物和反向引物组成， 具体的引物 对组合核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.24所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增番 茄内参基因Sl_LAT52的编号为SlGMO13、 SlGMO14两对引物对组合， 每对引物由正向引物和 反向引物组成， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.25‑SEQ ID NO.28所示。 3.一种检测番茄转基因元件和转基因品系的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权 利要求1所述的检测番茄转基因元件和品系的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增番 茄内参基因Sl_LAT52的引物对组合。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括多重PCR预 混液。 5.权利要求1或2所述的引物对组合、 权利要求3或4的述的检测试剂 盒在检测转基因番 茄及相关产品中的应用。 6.一种检测番 茄转基因元件和品系的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)以番茄转基因元件和品系的特征核苷酸序列及番茄内参基因进行参考， 得到多重 PCR引物； 2)得到待测番茄的DNA； 以所述DNA为模板， 将所述多重PCR引 物加入反应体系中， 进行 扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通量测序， 得到高通量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 以实现检测番 茄常见转基因元件和品系。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述扩增反应的环境/程序包括： 94℃ 预变 性5分钟； 第一步扩增反应， 94℃变性15s， 62℃～ 56℃退火30s， 12个T ouch Down cycle， (每 个循环退火及延伸的温度降低0.5℃)； 第二步扩增反应， 94℃变性15s， 57℃退火30S， 22个 cycle。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 反应体系包括： 总体系40μl， 引物预混液 2.5 μl、 2×buffer： 20 μl， 多重PCR扩增酶： 0.5 μl； 其余的用水补充； 剩余的用水补充； 所述高 通量文库的浓度大于2ng/ul 为合格。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114196782 A 2一种检测番茄 转基因成分和转基因 品系的引物组合、 试剂盒、 检测方法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 特别涉及一种检测番茄转基因成分和转基因品系的引 物组合、 试剂盒、 检测方法及应用。 背景技术 [0002]番茄(Solanum  lycopersicum)是一种世界范围内广泛种植的蔬菜， 又具有水果的 特征， 有“平民水果之王 ”之称。 在蔬菜生产中占有非常重要的地位。 由于番茄 具有独特的风 味， 营业价值高， 番茄以及番茄的制品广受大众的喜 爱。 随着番茄深入研究， 植株易转化， 转 基因番茄应用得到了迅速的发展。 然而转基因食品一直是人们关注的焦点， 因此， 开发高 效、 便捷的转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 目 前基于核酸的P CR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通定 性PCR、 巢式PCR、 环介导等温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相对于普通定 性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性 强， 然而引 物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通的多重P CR方法 可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过6重， 否则引物之间干扰较大， 影响检 测效果。 基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通量、 灵 敏度高、 特异性 强等优点， 且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因 作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些因 素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0004]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决的关键 问题。 发明内容 [0005]本发提供了一种面检测番茄转基因元件和品系的引物对组合、 试剂盒及检测方 法， 以解决基于定量PCR技术通量低、 基因芯片和数字PCR技术的转基因检测成本高的技术 问题。 [0006]本发提供的一种全面检测番茄转基因元件和品系的技术方案， 以11种检测常用的 番茄转基因元件p35S、 t35S、 pN OS、 pFMV35S、 tNOS、 tOCS、 Cry1A c、 PAT、 bar、 NPtII、 cp4epsps 和1个转基因品系huafan 1的特异性核苷酸序列即本发明所筛选的的靶标分子， 以及内参基 因Sl_LAT52作为检测目标， 设计多重PCR扩增引物对的核苷酸序列； 开发了14对引物， 所述 引物互相间不影响， 可以通过多重PCR进行高效的扩增 。 所述多重PCR引物组合可以用于开 发番茄转基因元件和品系检测试剂盒。 [0007]具体的技术方案为， 第一方面， 本申请提供了一种检测番茄转基因元件和品系引说　明　书 1/7 页 3 CN 114196782 A 3