(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210004393.8 (22)申请日 2022.01.04 (66)本国优先权数据 202110115137.1 2021.01.28 CN (71)申请人 江苏集萃药康生物科技股份有限公 司 地址 210000 江苏省南京市江北新区学府 路12号 (72)发明人 金晶　张瑞瑞　苏会敏　赵静　 (74)专利代理 机构 北京中政联科专利代理事务 所(普通合伙) 11489 专利代理师 谢恺 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01)C12N 15/85(2006.01) C12N 15/90(2006.01) C12N 9/22(2006.01) C12N 15/12(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) A61K 49/00(2006.01) (54)发明名称 一种CD16 3基因猪源化小鼠模型的构建方法 (57)摘要 本发明公开了sgRNA、 所述的表达盒、 重组载 体或细胞， 本发明还公开了sgRNA、 所述的表达 盒、 重组载体或细胞、 所述的引物对在CD163基因 编辑中的应用。 本发明还公开了一种打靶载体及 其制备方法和应用。 本发明最后还公开了一种 CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法以及鉴定 CD163基因猪源化小鼠的方法。 本发明通过 CRISRP/Cas9基因修饰的方法， 将猪的CD163基因 替换了小鼠的Cd163基因， 制备了CD163猪源 化小 鼠模型， 具有猪的功能性基因， 对于猪源相关病 毒的感染、 入侵以及免疫等研究有十分重要的意 义， 将可能成为筛选评价非洲猪瘟、 蓝耳病等相 关的药物及诊断产品的理想动物模 型， 为控制疫 情的发展带来 新的思路和策略。 权利要求书2页 说明书11页 序列表16页 附图4页 CN 114591953 A 2022.06.07 CN 114591953 A 1.sgRNA， 其特 征在于， 其具有： (i)、 如SEQ  ID NO： 1和/或SEQ  ID NO： 2所示的核苷酸序列； 或 (ii)、 如SEQ ID NO： 1和/或SEQ  ID NO： 2所示的核苷酸序列的互补序列； 或 (iii)、 与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的蛋白质， 但因遗传密码的简并性而与(i) 或(ii)的核苷酸序列不同的序列； 或 (iv)、 与(i)或(i i)或(iii)所述序列至少有70％同源性的序列。 2.表达盒、 重组载体或细胞， 其含有权利要求1所述的sgRNA。 3.根据权利要求2所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述重组载体为pUC57kan ‑T7‑ delG‑sgRNA。 4.扩增或鉴定权利要求1所述的sgRNA、 权利要求2所述的表达盒、 重组载体或细胞的引 物对。 5.根据权利要求4所述的引物对， 其特征在于， 所述引物对序列如SEQ  ID NO： 3和SEQ   ID NO： 4所示； 或/和SEQ  ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6所示。 6.权利要求1所述的sgRNA、 权利要求2所述的表达盒、 重组载体或细胞、 权利要求4或5 所述的引物对在CD16 3基因编辑中的应用。 7.一种打靶载体， 其特征在于， 所述打靶载体包括如下元件： 上游同源臂、 猪源CD163基 因、 Stop元件和下游同源臂， 所述上游同源臂序列如SEQ  ID NO： 34所示， 所述猪源CD163基 因序列如SEQ  ID NO： 35所示， 所述Stop元件序列如SEQ  ID NO： 37所示， 所述下游同源臂序 列如SEQ ID NO： 38所示。 8.根据权利 要求7所述的打靶载体， 其特征在于， 所述打靶载体的序列如SEQ  ID NO： 39 所示。 9.权利要求7或8所述的打靶载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将上游同源 臂、 下游同源臂、 合成的pCD163基因片段采用融合PCR的方式进行融合， 融合后的产物与 stop元件、 pMD18T载体进行sl ic连接即得。 10.权利要求7或8所述的打靶载体在制备CD16 3基因猪源化动物模型中的应用。 11.一种CD16 3基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)将权利要求1所述的sgRNA的DNA序列克隆至载体中， 构建重组质粒； 2)对步骤1)得到的重组质粒为模板进行PCR扩增获得模板， 对模板进行转录获得 sgRNA； 3)将sgRNA与Cas9蛋白孵育， 加入权利要求7或8的打靶载体后得到的混合液注射至小 鼠受精卵中， 移植至假孕雌鼠体内， 等小鼠出生后， 基因鉴定筛选出的中靶小鼠即阳性小 鼠； 4)将得到的阳性小鼠与野生型小鼠配繁， 出生的小鼠经过基因鉴定， 获得稳定遗传的 CD163猪源化小鼠动物模型。 12.根据权利要求11所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述 步骤3)和步骤4)的基因鉴定包括对小鼠鼠尾基因组DNA进行5 ’端和3’端的PCR鉴定， 若PCR 鉴定检测到预期条带， 则表明目标片段在靶位点发生了重组， 并同时对PCR产物进行测序， 测序正确即为阳性小鼠。 13.根据权利要求12所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114591953 A 25’端和3’端的PCR鉴定的PCR引物对 为SEQ ID NO： 11和SEQ  ID NO： 12所示或/和SEQ  ID NO： 13和SEQ ID NO： 14所示。 14.根据权利要求12所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述 5’端和3’端的PCR测序的引物对分别为SEQ  ID NO： 15和SEQ  ID NO： 16所示或/和SEQ  ID  NO： 17和SEQ  ID NO： 18所示。 15.根据权利要求12所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述 步骤4)的基因鉴定还 包括内部序列的PCR鉴定和 测序验证。 16.根据权利要求12所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述 内部序列的PCR鉴定引物对分别为SEQ  ID NO： 19和SEQ  ID NO： 20所示； SEQ  ID NO： 21和SEQ   ID NO： 22所示。 17.根据权利要求13所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述 步骤4)内部序列的测序验证引物包括SEQ  ID NO： 23、 SEQ ID NO： 24、 SEQ  ID NO： 25、 SEQ ID  NO： 26、 SEQ  ID NO： 27、 SEQ  ID NO： 28或/和SEQ  ID NO： 29。 18.根据权利要求11所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述 步骤4)的基因鉴定还包括qPCR检测， 根据5 ’端同源臂设计qPCR检测引物对， 使用野生型小 鼠作为对照， 检测插入的外源打靶片段在基因组中的拷贝数， 若小鼠拷贝数位于0.75～ 1.25之间， 则说明无随机插 入。 19.根据权利要求18所述的CD163基因猪源化小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 所述 步骤qPCR检测引物对分别为SEQ  ID NO： 30和SEQ  ID NO： 31所示； 或/和SEQ  ID NO： 32和SEQ   ID NO： 33所示。 20.鉴定CD163基因猪源化小鼠的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 通过提取权利要求 9～17获得的阳性小鼠尾巴基因组DNA， 分别采用SEQ  ID NO： 3和SEQ  ID NO： 4所示； 或/和 SEQ ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6所示； 或/和SEQ  ID NO： 11和SEQ  ID NO： 12所示或/和SEQ  ID  NO： 13和SEQ  ID NO： 14所示； 或/和 SEQ ID NO： 15和SEQ  ID NO： 16所示或/和 SEQ ID NO： 17 和SEQ ID NO： 18所示； 或/和SEQ  ID NO： 19和SEQ  ID NO： 20所示； SEQ  ID NO： 21和SEQ  ID  NO： 22所示； 或/和SEQ  ID NO： 23、 SEQ ID NO： 24、 SEQ  ID NO： 25、 SEQ  ID NO： 26、 SEQ  ID NO： 27、 SEQ ID NO： 28或/和SEQ  ID NO： 29； 或/和SEQ  ID NO： 30和SEQ  ID NO： 31所示； 或/和SEQ   ID NO： 32和SEQ  ID NO： 33所示。 21.权利要求11～19的方法构建的模型小鼠在筛选或制备猪瘟或蓝耳病的药物及诊断 产品中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114591953 A 3