(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210000606.X (22)申请日 2022.01.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113999811 A (43)申请公布日 2022.02.01 (73)专利权人 北京市农林科 学院 地址 100097 北京市海淀区曙光 花园中路9 号 (72)发明人 秦玉圣　刘彦　白佳桦　许晓玲　 冯涛　宋玉清　肖霖力　 (74)专利代理 机构 北京智为时代知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11498 代理人 王加岭　杨静 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01)C12Q 1/6881(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/74(2006.01) (56)对比文件 CN 106701659 A,2017.0 5.24 CN 112852712 A,2021.0 5.28 CN 113462635 A,2021.10.01 US 20170 65561 A1,2017.0 3.09 审查员 安玉苹 (54)发明名称 一种建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型的 方法 (57)摘要 本发明提供了一种建立卵泡囊肿的颗粒细 胞体外模型的方法。 通过在体外培养颗粒细胞液 中添加皮质醇刺激使颗粒细胞表达自发性卵泡 囊肿颗粒细胞的相关标志分子， 建立囊肿卵泡的 颗粒细胞体外培养模型。 该方法可用于体外研究 卵泡囊肿形成的分子机制或针对卵泡囊肿疾病 开发相关药物。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图6页 CN 113999811 B 2022.04.05 CN 113999811 B 1.一种建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型的方法， 其特 征在于， 其包括如下步骤： S1、 获取卵巢颗粒细胞进行体外培养； 采用含有青链霉素和胎牛血清的DMEM/F12培养 基培养颗粒细胞； S2、 将步骤S1培养后的颗粒细胞用不含胎牛血清的DMEM/F12培养基培养颗粒细胞， 之 后添加皮质醇继续培养， 细胞贴壁之后弃去上清液后， 用PBS洗涤细胞后备用， 取部分用于 步骤S3中的检测， 同时设置不含皮质醇的培 养基进行培 养作为对照； S3、 通过RT ‑QPCR与Western  Blot对体外培养的颗粒细胞进行囊肿卵泡颗粒细胞分子 进行检测， 若培养的皮质醇处理的颗粒细胞对比对照显著表达糖皮质激素受体 （GR） 、 11β ‑ 羟基类固醇脱氢酶 （1 1β‑HSD） ， 则说明卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型建模成功。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤S1中， 所述胎牛血清 的浓度为体积 浓度10%， 所述青链霉素为100  U/ml， 培养条件为37 °C、 5% CO2、 95%空气、 100%相对湿度的CO2 培养箱中培 养48 h。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤S2中， 不含胎牛血清FBS的DMEM/F12 培养的时间为12h， 皮质醇继续培 养细胞的时间为24h 。 4.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤S2中， 所述皮质醇的添加浓度为10 ‑ 2000mmol/L。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 在步骤S2中， 皮质醇的添加浓度为 1000mmol/L。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤S3中， 在RT ‑QPCR测定中， 检测GR的 mRNA表达量所用的引物如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示； 检测11β ‑HSD的mRNA表达量所 用的引物如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示； Western  Blot用于检测β ‑actin、 GR蛋白的表 达。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤S3中， 显著表达采用SPSS进行统计 分析， 当GR的mRNA表达量、 GR蛋白的表达量、 11β ‑HSD的mRNA表达量比对照高1.2倍及以上， 说明卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型建模成功。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113999811 B 2一种建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型的方 法。 背景技术 [0002]卵泡囊肿是严重影响女性生殖或母畜繁殖性能的常见繁殖障碍性疾病。 对人类而 言， 卵泡囊肿患者不能正常排卵， 严重影响女性的身心健康； 对母畜而言， 患病母畜屡配不 孕， 不仅使非生产天数增加， 而且年产仔数急剧下降。 卵泡囊肿虽然 是常见的繁殖障碍性疾 病， 但发病机理至今仍不明确。 研究表明， 在卵泡生长发育、 成熟时期， 机体受到伤病、 惊吓、 情绪剧烈波动等刺激时， 下丘脑 ‑垂体‑肾上腺轴分泌活动加强， 使肾上腺糖皮质激素分泌 水平急剧升高， 导致排卵前的成熟卵泡无法排卵， 卵泡持续存在不破裂、 卵泡液持续增多 形 成囊肿卵泡。 由于缺乏合适的研究模 型， 对卵泡囊肿的形成、 发生、 发展、 治疗等研究始终停 滞不前， 目前尚无准确预测体内卵泡囊肿形成的方法， 并且缺乏有效治疗手段。 [0003]目前对母畜卵泡囊肿无法预测， 只有通过B超等工具或对发情异常母畜淘汰屠宰 后观察卵巢， 此时才知道卵泡发生了囊肿， 导 致不能及时发现并治疗。 [0004]现有治疗卵泡囊肿的有效方法不仅少， 而且复发率高。 颗粒细胞是卵泡中最重要 的体细胞， 作为卵泡结构和功能的重要组成部分， 对卵泡生长发育、 成熟具有决定性作用。 伴随着卵泡生长、 闭锁、 排卵、 黄体形成， 颗粒细胞的不仅在形态和功能上发生相对应的变 化参与调控卵泡和 卵母细胞的生长发育， 而且通过表达促性腺激素 受体、 分泌类固醇激素、 细胞因子、 生长因子等为卵泡生长发育维持卵泡正常微环境。 但迄今为止， 没有关于针对卵 泡囊肿， 建立囊肿卵泡颗粒细胞体外模型 的报道。 如何能建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模 型， 将对研究卵泡囊肿形成的分子机制及研发针对性药物具有重要意义。 但是目前还没有 一种有效的方法， 能建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型。 发明内容 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明提供一种建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型的方 法。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用以下的技 术方案为： [0007]一种建立卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型的方法， 其包括如下步骤： [0008]S1、 将卵泡颗粒细胞进行体外 培养； [0009]S2、 将步骤S1培养后的颗粒细胞用不含胎牛血清的DMEM/F12培养基培养颗粒细胞 培养， 之后添加皮质醇继续培养， 细胞贴壁之后弃去 上清液， 用PBS 洗涤细胞后备用， 取部 分 用于步骤S3中的检测， 同时设置不含皮质醇的培 养基进行培 养作为对照； [0010]S3、 通过RT ‑QPCR与Western  Blot对体外培养的颗粒细胞进行囊肿卵泡颗粒细胞 分子标志进行检测， 若培养的皮质醇处理的颗粒细胞对比对照显著表达GR、 11β ‑HSD， 则说 明卵泡囊肿的颗粒细胞体外模型成功。说　明　书 1/5 页 3 CN 113999811 B 3