(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210002261.1 (22)申请日 2022.01.04 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 郝彦玲　李雪利　翟征远　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 黄爽 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 1/02(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 免疫磁分离-环介导等 温扩增快速检测芽孢 杆菌四环素耐药基因tetL的方法 (57)摘要 本发明提供一种免疫磁 分离‑环介导等 温扩 增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的方 法。 所述方法包括将羧基磁珠与芽孢杆菌多克隆 抗体偶联制备免疫磁珠， 然后将免疫磁珠添加到 待测样品， 得到免疫磁珠 ‑芽孢杆菌复合物(磁细 菌)； 通过煮沸法提取芽孢杆菌核酸； 针对四环素 耐药基因tetL 设计特异性LA MP引物， 将上述核 酸 加入LAMP反应体系， 于实时荧光定量PCR仪扩增 并检测荧光信号。 本方法可以快速检测巴氏杀菌 乳中芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL， 降低耐药 基因水平转移带来的危害。 该方法特异性强， 灵 敏度高， 检测时间短， 实现对耐药芽孢杆菌的快 速检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 114292934 A 2022.04.08 CN 114292934 A 1.芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的LAMP检测引物组合， 其特征在于， 所述引物组合由 引物F3、 B3、 FIP、 BIP和LB组成， 它 们的序列分别如SEQ  ID NO:1‑5所示。 2.用于分离和富集芽孢杆菌的免疫磁珠， 其特征在于， 所述免疫磁珠是将羧基磁珠经 过活化后， 在磁珠表面偶联芽孢杆菌特异性 抗体制得的。 3.根据权利要求2所述的免疫磁珠， 其特 征在于， 所述免疫磁珠的制备 方法包括： 取羧基磁珠0.8 ‑1mg于3mL  PB中， 磁分离10min后移去上清， 重复清洗3次， 复溶于3mL   PB， 每次复溶后超声10s； 分别称取1mg的乙基二甲氨基碳化二亚胺和N ‑羟基硫代琥珀酰亚 胺， 使用100 μL的PB溶解， 随后将两种溶液立即加入磁珠溶液， 在37℃180 ‑220rpm摇床反应 1‑2h； 磁分离10min后移去上清， 使用PB 清洗2次， 最后使用3mL  PB复溶； 取100 μg芽孢杆菌特 异性抗体加入上述磁珠溶液， 涡旋混匀， 在37℃220rpm摇床反应2h； 称取40mg脱脂乳溶于 400 μL PB， 并加入上述溶液， 封闭反应4h； 磁分离10min后移去上清， 使用PB清洗2次， 最后使 用1mL复溶 液复溶， 4℃保存； 其中， 所述磁珠的平均粒径为180nm； 所述PB的浓度为0.01M， pH  6.0； 所述复溶 液为25％蔗糖+1％脱脂 乳+0.7％Procl lin。 4.根据权利要求2所述的免疫磁珠， 其特征在于， 所述芽孢杆菌特异性抗体为多克隆抗 体； 多克隆抗体采用如下方法制得： 1)制备免疫原； 2)免疫动物； 3)测定血清效价； 4)纯化 抗血清； 5)抗体特异性检测。 5.用于检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述 的引物组合和权利要求2 ‑4任一项所述的免疫磁珠。 6.免疫磁分离 ‑环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的方法， 其特 征在于， 采用权利要求5所述试剂盒进行检测； 所述方法包括免疫磁分离、 核酸 提取和环介导 等温扩增的步骤。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述免疫磁珠的添加量 为20 μL。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 采用煮沸法提取芽孢杆菌核酸； 反应条件 为： 100℃， 10mi n。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 进行环介导等温扩增所使用的LAMP反应体 系为： 12.5 μL  LAMP混合液， 2.5 μL引物混合物， 模板 5 μL， 染料0.5 μL， 超纯 水补至25 μL； 其中， 所述 LAMP混合液含有80 00U/mL Bst 2.0聚合酶； 所述引物混合物含有引物F3/B3各0.2 μmol/L， 引物FIP/BIP各1.6μmol/L以及引物LF/ LB各0.4 μmo l/L； 所述LAMP反应程序为： 6 5℃， 1min， 共45‑49个循环， 每个循环结束后收集 荧光信号。 10.权利要求5所述试剂 盒或权利要求6 ‑9任一项所述方法在样品中芽孢杆菌检测中的 应用； 所述芽孢杆菌包括 蜡样芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114292934 A 2免疫磁分离 ‑环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药 基因tetL的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技术领域， 具体地说， 涉及一种免疫磁分离 ‑环介导等温扩增 快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的方法。 背景技术 [0002]抗生素被大量应用于治疗奶牛乳房炎等疾病， 导致生牛乳中耐药细菌累积， 在经 过巴氏杀菌处理后， 耐热 的芽孢杆菌仍存在于乳中， 使得巴氏杀菌乳和利用巴氏杀菌乳生 产的产品含有耐药芽孢杆菌。 耐药芽孢杆菌携带 的耐药基因， 尤其是四环素耐药基因能通 过质粒或可移动元件转移给金黄色葡萄球菌和肠球菌， 最终可能通过食物链转移给人体， 给人类健康带来威胁。 因此， 有必 要加强乳制品中耐药芽孢杆菌的检测， 降低耐药基因水平 转移可能带来的危害。 [0003]目前耐药芽孢杆菌检测包括培养法和分子生物学两种手段。 基于培养法的检测因 灵敏性差， 耗时长， 无法实现快速检测。 分子生物学中环介导等温扩增(LAMP)是一种体外核 酸扩增技术， 在恒温条件下即可对目标基因大量扩增， 具有反应快速、 操作简单和特异 性强 等优点。 目前研究通常将LAMP检测和增菌培养相结合， 从而提高LAMP检测方法的灵敏度， 但 是增菌培养一般需要18 ‑24h， 延长了整体检测时间， 无法实现快速检测 。 另外， 在实际检测 巴氏杀菌乳中耐药芽孢杆菌时， 由于基质复杂， 同时可能存在其它菌的干扰， 很难对耐药芽 孢杆菌进行高灵敏、 高特异性的检测。 因此， 如何建立一种特异性强、 灵敏度高的快速检测 巴氏杀菌 乳中耐药芽孢杆菌的方法， 仍是目前亟 待解决的技 术问题。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种免疫磁分离 ‑环介导等温扩增(IMS ‑LAMP)快速检测芽孢 杆菌四环素耐药基因tetL的方法。 [0005]为了实现本发明目的， 第一方面， 本发明提供一套芽孢杆菌四环素耐药基因tetL 的LAMP检测引物组合， 所述引物组合由引物F3、 B3、 FIP、 BIP和LB组成， 它们的序列分别如 SEQ ID NO:1‑5所示。 [0006]第二方面， 本发明提供一种用于分离和富集芽孢杆菌 的免疫磁珠， 所述免疫磁珠 是将羧基 磁珠经过活化后， 在磁珠表面偶联芽孢杆菌特异性 抗体制得的。 [0007]具体地， 所述免疫磁珠的制备 方法包括： [0008]取羧基磁珠0.8 ‑1mg于3mL  PB中， 磁分离10min后移去上清， 重复清洗3次， 复溶于 3mL PB， 每次复溶后超声10s； 分别称取1mg的乙基二甲氨基碳化二亚胺(EDC)和N ‑羟基硫代 琥珀酰亚胺(NHSS)， 使用100 μL的PB溶解， 随后将两种溶液立即加入磁珠溶液， 在37℃180 ‑ 220rpm摇床反应1 ‑2h； 磁分离10min后移去上清， 使用PB清洗2次， 最后使用3mL  PB复溶； 取 100 μg芽孢杆菌特异性抗体加 入上述磁珠溶液， 涡旋混匀， 在37℃220rpm摇床反应2h； 称取 40mg脱脂乳溶于400 μL  PB， 并加入上述溶液， 封闭反应4h； 磁分离10min后移去上清， 使用PB说　明　书 1/7 页 3 CN 114292934 A 3