(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210006972.6 (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 深圳汉亚 生物科技 合伙企业 （有限 合伙） 地址 518000 广东省深圳市福田区福田街 道岗厦社区彩田路3069号星河世纪A 栋3613D10 (72)发明人 宋希凡　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 代理人 张金铭 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组 合物、 试剂盒及检测结核分支杆菌耐药性的方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测结核分支杆菌耐药 基因的核酸组合物、 试剂盒及检测结核分支杆菌 耐药性的方法， 涉及医学检测技术领域。 本发明 结合单碱基延伸反应技术， 通过确定katG315、 rpoB435和embB306基因的待测突变位点， 设计 出 扩增引物和各突变位点的延伸引物， 经过PCR扩 增、 消化处理、 延伸反应后使用树脂纯化， 纳升点 样制备样 本并上质谱检测， 最终经过比对确定位 点突变明细， 从而判定结核分支杆菌的对异烟 肼、 利福平和乙胺丁醇的耐药性。 检测结果可广 泛应用于临床检验、 疾病预防、 流行病筛查、 进出 口检验检疫等领域。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图1页 CN 114292935 A 2022.04.08 CN 114292935 A 1.一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物， 其特征在于， 其包括PCR扩增引物 组， 所述PCR扩增引物组包括第一引物组、 第二引物组、 第三引物组、 第四引物组、 第五引物 组和第六引物组中的至少一组引物组； 所述第一引物组如SEQ  ID NO.1‑2所示， 所述第二引物组如SEQ  ID NO.3‑4所示， 所述 第三引物组如SEQ  ID NO.5‑6所示， 所述第四引物组如SEQ  ID NO.7‑8所示， 所述第五引物 组如SEQ ID NO.9‑10所示， 第六引物组如SEQ  ID NO.17‑18所示。 2.根据权利要求1所述的检测结核分支杆菌耐药基因 的核酸组合物， 其特征在于， 所述 核酸组合物还 包括单碱基延伸引物， 所述单碱基延伸引物选自如下至少一种的延伸引物： SEQ ID NO.11所示的单碱基延伸引物1、 SEQ  ID NO.12所示的单碱基延伸引物2、 SEQ   ID NO.13所示的单碱基延伸引物3、 SEQ  ID NO.14所示的单碱基延伸引物4、 SEQ  ID NO.15 所示的单碱基延伸引物5和SEQ  ID NO.16所示的单碱基延伸引物6 。 3.一种试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1 ‑2任一项所述的检测结核分支杆菌耐药 基因的核酸组合物。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括碱性磷酸酶以及 ddNTP； 优选地， 所述d dNTP为经 过质量修饰的ddNTP。 5.一种结核分支杆菌耐药基因的检测芯片， 其特征在于， 所述检测芯片包括权利要求 1‑2任一项所述的检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物。 6.一种检测结核分支杆菌耐药性的方法， 其特征在于， 所述方法用于非疾病 诊断目的， 所述检测结核分支杆菌耐药性是指： 确定待测样品的目标位点是否存在突变， 若产生突变 则判断待测样品具有耐药性； 所述 目标位点选自结核分支杆菌的如下位点中的至少一种： katG基因315密码子位点， rpoB基因的435密码子位点、 445密码子位点和450密码子位点， embB基因的3 06密码子第一 位点和306密码子第三 位点； 所述方法包括： 使用权利 要求1所述的PCR扩增引物组对待测 样品的模板DNA进行扩增， 将扩增获得的扩增产物进行消 化反应， 然后采用权利要求2所述的单碱基延伸引物对消 化 反应处理后的扩增产 物进行单碱基延伸反应， 经纯化， 然后使用质谱仪检测， 通过质谱仪的 分子量信息判读耐药性。 7.根据权利要求6所述的检测结核分支杆菌耐药性的方法， 其特征在于， 通过质谱仪的 分子量信息判读耐药性的方法包括： 若katG基因第315位氨基酸密码子 的第二位所对应的模板链的碱基由G突变为A、 T、 C， 则判断待测样品具有结核分支杆菌耐药性； 若rpoB基因第435位氨基酸密码子 的第二位所对应的模板链的碱基由A突变为G、 T、 C， 则判断待测样品具有结核分支杆菌耐药性； 若rpoB基因第445位氨基酸密码子 的第一位所对应的模板链的碱基由C突变为G、 T、 A， 则判断待测样品具有结核分支杆菌耐药性； 若rpoB基因第450位氨基酸密码子 的第二位所对应的模板链的碱基由C突变为G、 T、 A， 则判断待测样品具有结核分支杆菌耐药性； 若embB基因第306位氨基酸密码子 的第一位所对应的模板链的碱基由G突变为C、 T、 A， 则判断待测样品具有结核分支杆菌耐药性；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114292935 A 2或， 若embB基因第306位氨基酸密码子的第三位所对应的模板链的碱基由G突变为C、 T、 A， 则判断待测样品具有结核分支杆菌耐药性。 8.根据权利要求6所述的检测结核分支杆菌耐药性的方法， 其特征在于， 所述纯化是脱 盐纯化， 优选地， 所述脱盐的方式为树脂脱盐， 优选地所述树脂脱盐包括： 将延伸反应后的 反应液通过离 子交换树脂进行脱盐纯化。 9.根据权利要求7所述的检测结核分支杆菌耐药性的方法， 其特征在于， 所述纯化后还 包括样品转移， 所述样品转移是采用手工点样、 使用纳升点样仪器或微升点样仪器进行点 样。 10.根据权利要求9所述的检测结核分支杆菌耐药性的方法， 其特征在于， 采用所述纳 升点样仪器设置自动点样流程进行自动点样包括： 先在靶点处滴加基质， 待完全干燥后覆 盖滴加待测样本 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114292935 A 3