(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210002485.2 (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 北京华诺奥美 基因医学检验实验室 有限公司 地址 100000 北京市大兴区中关村科技园 区大兴生物医药产业基地永旺西路26 号院13号楼1层101室 (72)发明人 于超计　吴文立　王倩玉　肖江山　 魏星　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 代理人 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种SNRPN父源缺失的检测引物组、 试剂盒 及非诊断目的 的检测方法 (57)摘要 本发明属于生物检测技术领域， 公开了一种 SNRPN父源缺失的检测引物组、 试剂盒及非诊断 目的的检测方法。 本方案通过设计了SNRPN位点 检测的引物组， 及该引物组制成的试剂盒， 能够 快速、 准确且灵敏地检测出小胖威利综合征中 SNRPN父源缺失 （或功能缺陷） ， 填补临床检测空 白， 从常染色体基因突变层面辅助找出造成小 胖 威利综合征的原因； 实验结果重复性好， 精密度 高。 最快能在90分钟内完成检测， 节约检测时间， 加快检测效率。 检测仪器仅依赖普通PCR仪， 临床 推广性高。 当父源性小胖威利综合征中SNRPN缺 失 （或功能缺陷） 时， 患儿即表现出小胖威利的表 型， 针对此突变的检测对于优生优育有着重大意 义。 权利要求书1页 说明书12页 序列表3页 附图2页 CN 114015771 A 2022.02.08 CN 114015771 A 1.一种SNRPN父源缺失的检测引物组， 其特 征在于， 所述引物组为SNRPN 位点的引物组； 所述SNRPN 位点引物组包括非甲基化引物组和甲基化引物组； 所述非甲基化引物组包括第一引物和第二引物； 所述第一引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.1： 5′ ‑TGTGGTAAATAAGTATGTTTGTGTGGTT‑3′； 所述第二引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.2： 5′ ‑ACTACAACAACAACAAACTTCACAC‑3′； 所述甲基化引物组包括第三引物和第四引物； 所述第三引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.3： 5′ ‑  GTAAATAAGTACGTTTGCGCGGTC‑3′； 所述第四引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.4 ： 5′ ‑  CTACAACAACGACAAACTTCGCAC‑3′。 2.根据权利要求1所述的SNRPN父源缺失的检测引物组， 其特征在于， 所述第一引物和 第三引物的5 ′端均标记生物素。 3.根据权利要求1所述的SNRPN父源缺失的检测引物组， 其特征在于， 所述第二引物5 ′ 端标记TAMARA； 第四引物5 ′端标记Dig。 4.一种SNRPN父源缺失的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括含有权利要求1所 述SNRPN位点引物组的检测液。 5.根据权利要求4所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包 括扩增反应液、 阳性对照品、 阴性对照品和层析 条。 6.根据权利要求5所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒， 其特征在于， 所述扩增反应液 包括taq DNA聚合酶、 4种dNTP及各种PCR扩增反应液离 子。 7.根据权利要求5所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照品 为SNRPN父源缺失或功能缺陷的细胞系DNA； 所述阴性对照品为SNRPN 正常的血 液DNA。 8.根据权利要求5所述的SNRPN父源缺失的检测试剂盒， 其特征在于， 所述层析条为包 被胶体金颗粒和抗体的层析 试纸。 9.一种SNRPN父源缺失的非诊断目的检测方法， 其特征在于， 采用权利要求4 ‑8中任一 项所述SNRPN父源缺失的试剂盒进行检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114015771 A 2一种SNRPN父源缺失的检测引物组、 试剂盒及非诊断目的 的检 测方法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种S NRPN父源缺失的检测引物组、 试剂 盒及非诊断目的 的检测方法。 背景技术 [0002]小胖威利综合征， 正式医学名为普拉德 ‑威利综合征（英文Prader ‑Willi  Syndrome， 简称PWS） ， 因来自父亲的第15号染色体长臂 （位置15q11 ‑q13） 基因突变导致的先 天性终身性疾病， 非孟德尔遗传的表 观遗传性罕见疾病， 是多系统化异常的复杂综合征。 [0003]小胖威利以肌张力低、 生长发育迟缓、 智能障碍、 多食、 肥胖及性腺功能减退为主 要临床特征。 因下视丘功能障碍， 患者无饱腹感， 长期的强烈饥饿感导致过度摄食造成威胁 生命的肥胖。 目前尚无办法根治， 终身需在监管下生活。 发病 无种族和性别差异， 国内发病 率不明， 预计中国5 ‑10万患者， 每年新增1500 ‑4500例 （按照国外发病率1/12000至1/15000 估算） 。 [0004]目前有关研 究显示小胖威利综合征中存在SNRPN、 NDN、 MAGEL2、 MKRN3和Cl5orf  2 印记基因， 它们仅存在于父源15号染色体的等位基因上。 SN RPN位于印迹中心区域， 可编码 5 种snoRNAs， 被认为与小胖威利表型有密切关系， 也是最可靠的诊断位点， 可检出绝大多数 小胖威利， 并可用于产前诊断。 正常人母源性小 胖威利综合征中SNRPN的CpG岛高度甲基化， 而父源SNRPN的CpG岛未甲基化， 因此母源性基因失活， 而父源性SNRPN基因有表达 （遗传印 记） 。 当父源性小胖威利综合征中SNRPN父源缺失 （或功能缺陷） 时， 患儿即表现出小胖威利 的表型。 [0005]小胖威利的致病原因及遗传机制非常特殊且复杂， 绝大多数病例为新的突变， 即 父母亲皆正常， 仅有极少数为遗传。 大部分可归因于在卵子(精子)或胚胎形成阶段产生的 基因错误， 也就是在15号染色体长臂上有10多个 基因被遗漏或抑制。 [0006]小胖威利的病因肇因于第15号染色体印迹基因区的基因缺陷， 且此基因缺陷来自 父亲， 或同时拥有两条来自母亲的带有此缺陷的第15号 染色体， 若此基因缺陷来自母亲， 则 会造成Angelman  syndrome(天使人综合征)。 [0007]目前小胖威利综合征的辅助 诊断方法有： （1） 高分辨率染色体分析 （H RB） ； （2） 荧光 原位杂交法 （FISH） ； （3） 甲基化 ‑特异性聚合酶链反应 （MS ‑PCR） ； （4） 甲基化特异性多重连接 依赖性探针扩增法 （MS ‑MLPA） ； （5） 染色体微阵列分析 （CMA） 又称 “分子核型分析 ”。 此外， 还 可使用全外显子测序(父源缺失、 突变)、 微卫星标记、 全基因组SNP微阵列芯片、 Souther n印 迹杂交、 DNA甲基化(MSP)、 Affymetrix  CytoScan芯片。 《Parent ‑of‑Origin Testing for  15q11‑q13 Gains by Quantitative  DNA Methylation  Analysis》 公开的技术也是需要依 赖荧光定量P CR仪器。 这些检测方法要么依赖于特定的检测设备， 如荧光定量P CR仪器、 荧光 显微镜、 一代测序仪等； 要么， 具有操作复杂、 技 术要求高。 [0008]核酸胶体金免疫层析技术是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上形成U说　明　书 1/12 页 3 CN 114015771 A 3