(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210006997.6 (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 海南大学 地址 570228 海南省海口市美兰区人民大 道58号 (72)发明人 陈银华　向黎　牛晓磊　夏薇　 耿梦婷　王红刚　朱寿松　黄思源　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 代理人 赵晓娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种适用 木薯抗病研究的内参基因的筛选 方法及应用 (57)摘要 本发明提供一种适用木薯抗病研究的稳定 内参基因的筛选方法及应用， 包括： 1)选取木薯 候选内参基因， 进行内参引物设计； 2)木薯组培 苗进行外源激素诱导处理、 鞭毛蛋白处理， 及不 同品种的不同组织部位取样， RNA提取， 合成cDNA 样本； 3)对候选内参基因引物采用cDNA样本进行 qRT‑PCR反应， 采用geNorm法、 NormFinder法和 BestKeeper法和ΔCT法， 对 候选内参基因在外源 激素诱导处理、 鞭毛蛋白处理后和不同木薯组织 部位的表达稳定性分析， 筛选出特定条件下木薯 内参基因Manes.05G133600表达最稳定， 可用作 实时荧光定量PCR的稳定内参， 为木薯的抗病分 子生物学研究奠定方法学基础。 权利要求书2页 说明书9页 序列表5页 附图4页 CN 114410816 A 2022.04.29 CN 114410816 A 1.一种适用木薯抗病研究的内参基因的筛 选方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： S1、 选取不同品种、 不同组织中的木薯转录组原始数据集中的基因， 计算RPKM值作为不 同基因的表达量； 并根据其表达量， 对其基因表达量的变异系数CV 值进行排序， 筛选出CV值 低于0.3的基因， 作为候选内参基因； 并对其候选内参基因进行实时荧光定量PCR内参基因 引物设计； S2、 将木薯组培苗分别进行外源激素诱导处理、 鞭毛蛋白处理后取样， 以及对长势均一 的不同品种木薯组培苗的不同组织部位的进行取样， 分别作为实验材料， 进行RNA提取， 合 成cDNA样本； S3、 对候选内参基因引 物分别采用cDNA样本进行qRT ‑PCR反应， 检测表达量， 根据其对 应Ct值判断基因 的表达丰度； 并分别采用geNorm法、 NormFinder法和BestKeeper法和ΔCT 法， 对候选内参基因在外源激素诱导处理、 鞭毛蛋白处理后和不同木薯组织部位的表达稳 定性分析， 根据分析结果， 对候选内参基因进行综合稳定性排序， 筛选出稳定表达的木薯内 参基因。 2.如权利要求1所述的一种适用木薯抗病研究的内参基因的筛选方法， 其特征在于： 步 骤S2中， 所述外源激素诱导处理包括采用茉莉酸、 水杨酸和乙烯利的三种外源激素诱导处 理。 3.如权利要求2所述的一种适用木薯抗病研究的稳定内参基因的筛选方法， 其特征在 于： 所述外源激素诱导处理， 具体为： 对木薯组培苗分别采用质量浓度为100 μmol/L的茉莉 酸、 水杨酸和乙烯利进行整株喷雾 接种， 并在不同时间点对其叶片进行 取样。 4.如权利要求1所述的一种适用木薯抗病研究的稳定内参基因的筛选方法， 其特征在 于： 步骤S2中， 所述鞭毛蛋白处理是采用质量浓度为0.8～1.2 μmol/L的细菌鞭毛蛋白Flg22 进行处理。 5.如权利要求4所述的一种适用木薯抗病研究的稳定内参基因的筛选方法， 其特征在 于： 所述鞭毛蛋白处理， 具体为， 取木薯组培苗的幼嫩叶片， 制备原生质体， 采用1μmol/L的 细菌鞭毛蛋白Flg2 2进行接种处 理， 并在不同时间点对其叶片进行 取样。 6.如权利要求5所述的一种适用木薯抗病研究的稳定内参基因的筛选方法， 其特征在 于： 所述木薯 原生质体的制备 方法， 包括如下步骤： (1)将木薯叶片在甘露醇中切成细条， 转入酶解液中， 26℃40rpm黑暗条件下酶解16h； 酶解液为： 1.6％纤维素酶， 0.8％离 析酶， 9％甘露醇， 0.02mol/L  KCl， 0.2mol/L  MES， 0.1％ BSA， 0.01mo l/L CaCl2； (2)采用W5溶液润洗过的纱布过滤酶解产物， 弃滤渣， 将所得液体室温100g， 离心3min， 收集离心管底部的原生质体； W5溶液为： 0.45％NaCl， 0.92％CaCl2， 2.5mmol/L  KCl， 0.1mol/L MES； (3)再次加入10mL  W5溶液悬浮原生质体， 离心力100g， 离心3min， 重复洗涤2次， 即得到 木薯原生质体。 7.如权利要求1所述的一种适用木薯抗病研究的稳定内参基因的筛选方法， 其特征在 于： 步骤S2中， 所述木薯组培苗的不同组织部位是经过MS 培养基60d 的木薯根、 茎、 叶的组织 部位。 8.一种如权利要求1～7中任意一项所述的适用木薯抗病研究的稳定内参基因的筛选权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114410816 A 2方法筛选获得的内参基因， 其特征在于： 所述内参基因包括Manes .05G133600、 Manes.02G18310 0、 Manes.14G0 08100、 Manes.0 5G144500、 Manes.02G1375 00和EF1α 。 9.如权利要求8中所述的内参基因， 其特 征在于： 所述内参基因为Manes.0 5G133600。 10.如权利要求8中所述的内参基因的应用， 其特征在于： 所述Manes.05G133600、 Manes.02G183100、 Manes.14G008100、 Manes.05G144500、 Manes.02G137500和E F1α 作为内参 基因， 用于 木薯组织发育及病害胁迫的抗病性分子生物学研究中。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114410816 A 3