(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210009531.1 (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 云南瑞栢泰生物科技有限公司 地址 650217 云南省昆明市经济技 术开发 区信息产业基地春漫大道8 0号云南海 归创业园1幢9 28号 (72)发明人 张薇　许绍坤　信爱国　王耕　 粟柯衡　 (74)专利代理 机构 北京成高专利代理事务所 (普通合伙) 16047 专利代理师 姚燕春 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种针对鸭细小病毒的核酸快速 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种针对鸭细小病毒的核酸 快速检测方法， 涉及核酸检测领域， 包括如下检 测方法步骤： 步骤一： 检测试剂和材料准备， 检测 试剂包括检测猪是否感染鸭细小的引物组、 反应 液、 阴性对照组和材料， 引物组包括引物1、 引物 2、 引物3、 引物4、 引物 5和引物6， 引物组 中各引物 干粉1OD； 反应液包括核酸反应液， 核酸反应液包 括具有链置换活性 的DNA聚合酶、 Buffer、 dNTP、 MgSO4、 Betaine和荧光染料； 阴性对照组包括不 含目的基因反应液； 材料包括未感染鸭细小病毒 的鸭血清样 本和鸭坦步苏病毒核酸样本； 本发明 的试剂盒可用于多个检测平台上， 不仅可以用在 基因快速检测仪和定量PCR仪， 也可以用在其他 可以提供恒定温度的设备 上， 如金属浴等。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 114672590 A 2022.06.28 CN 114672590 A 1.一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述针对鸭细小病毒的核 酸快速检测方法包括： 步骤一： 检测试剂和材料准备， 检测试剂包括检测猪是否感染鸭细小的引物组、 反应 液、 阴性对照组和材料， 引物组包括引物1、 引物2、 引物3、 引物 4、 引物5和引物6， 引物组中各 引物干粉1OD； 反应液包括核酸反应液， 核酸反应液包括具有链置换活性的DNA聚合酶、 Buffer、 dNTP、 MgSO4、 Betaine和荧光染料； 阴性对照组包括不含目的基因反应液； 材料包括 未感染鸭细小病毒的鸭血清样本和鸭坦 步苏病毒 核酸样本； 步骤二： 病毒DNA提取， 使用病毒DNA提取 试剂盒提取样本DNA； 步骤三： 引物稀释， 将试剂盒中引物 1和引物2稀释成40uM,引物3和引物4稀释成5uM,引 物5和6稀释成20uM； 步骤四： 扩增反应 体系， 反应浓 缩液15ul， 引物组6ul,模板4ul和总反应 体系25ul； 步骤五： 扩增曲线和溶解曲线获得， 将步骤四中的反应浓缩液、 引物组、 模板和总反应 体系25混匀， 放入定量PCR仪或恒温荧光基因扩增仪， 设置65℃、 30s/循环， 60个循环或者65 ℃30分钟， 通过FAM通道， 每15S收集一次荧光信号， 扩增结束后设置98℃ ‑80℃的退火程序， 间隔10‑15秒收集一次荧光信号； 可选循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线和 基因快速检 测系统中获得扩增曲线和溶解曲线； 步骤六： 判定， 根据步骤五所获得扩增曲线和溶解曲线 进行判定 。 2.根据权利要求1所述的一种针对 鸭细小病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述 引物1、 引物 2、 引物3、 引物4、 引物5和引物6具体为： 引物1： TGA ACGCTCCGGTAGCTCTCT TGATTGGCACATTGAGATGG 引物2： AAAAGCACCACTTGAAAATGCCTCCAATGAAATAGTCTGTG GC 引物3： GAGCATCA AGCTTCAACTGT 引物4： TA ATCTCCAGAACTGGGTCT 引物5： AGC CAGTGTTTTGCAGAGGT 引物6： CGAGCAGA ATTGCTACTA ACAA。 3.根据权利要求1所述的一种针对 鸭细小病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述 引物组设计根据鸭细小病毒特异性保守片段， 使用Primer  explorer软件设计引物组。 4.根据权利要求1所述的一种针对 鸭细小病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述 引物稀释过程中， 稀释引物要达到的浓度(pmol/ul)＝母 液浓度(pmol/ul) ×汲取母液的体 积(ul)÷(汲取母液的体积(ul)+加水量(ul)。 5.根据权利要求1所述的一种针对 鸭细小病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述 引物组中引物1、 引物 2、 引物3、 引物4、 引物5和引物6对应目标序列8个特异区域。 6.根据权利要求1所述的一种针对 鸭细小病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述 基因快速检测系统中， 64℃、 3 0分钟， 获得扩增曲线和溶解曲线。 7.根据权利要求1所述的一种针对 鸭细小病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述 步骤六过程中， 根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定， 扩增曲线有明显的 “S”型曲线， 以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐， 则判定为阳性结果； 扩增曲线没有出现明显 “S”型曲 线， 则判定为阴性结果； 扩增曲线有明显 “S”型曲线， 但溶解曲线不峰型单一判定为非特异 性扩增； 阴性质控品的检测结果是 阴性结果， 则是本次实验有效， 否则本次实验无效。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672590 A 2一种针对鸭细小病毒 的核酸快速检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测领域， 具体是一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法。 背景技术 [0002]鸭细小病毒是细小病毒科依赖病毒属成员， 1～30日龄雏番鸭最为易感， 番鸭细小 病毒的典型临床症状为呼吸困难、 胰腺坏死、 渗出性肠炎导致的腹泻等， 感染番鸭的死亡率 可达10％～8 0％， 并且与日龄呈负相关， 且会影响病愈番鸭的生长发育速度， 使其 失去经济 价值。 番鸭细小病毒病， 该病在世界范围内呈广泛流行， 由于其高发病率和高死亡率， 使番 鸭养殖业遭受了巨大的经济损失。 MDPV是单股DNA病毒， 其长度约为5.1kb。 基因组两侧翼有 约 440个碱基组成的末端倒置的重复序列。 [0003]目前检测鸭细小的方法有RT ‑PCR、 荧光定量PCR、 ELISA、 病毒分离、 病毒中和等SVV 实验室诊断方法， 但上述方法操作繁琐， 需依赖昂贵的仪器， 且耗时较长， 在2h以上。 环介导 等温扩增 技术是一种新型 的核酸扩增方法， 其反应过程始终维持在恒定的温度下进行。 根 据鸭细小病毒诊断标准， 结合流行病学 史、 临床表现， 实验室PCR核酸检测是鸭细 小确诊、 治 疗效果和治愈的重要依据。 [0004]因此， 本领域技术人员提供了一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法， 以解决 上述背景技 术中提出的问题。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法， 以解决上述背 景技术中提出的目前检测鸭细小的方法有RT ‑PCR、 荧光定量PCR、  ELISA、 病毒分离、 病毒中 和等SVV实验室诊断方法， 但上述方法操作繁琐， 需依赖昂贵的仪器， 且耗时较长， 在2h以 上。 环介导等温扩增 技术是一种新型 的核酸扩增方法， 其反应过程始终维持在恒定的温度 下进行。 根据鸭细 小病毒诊断标准， 结合流行病学 史、 临床表现， 实验室P CR核酸检测是鸭细 小确诊、 治疗效果和治愈的重要依据的问题。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供如下技 术方案： [0007]一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法， 包括： [0008]步骤一： 检测试剂和材料准备， 检测试剂包括检测猪是否感染鸭细小的引物组、 反 应液、 阴性对照组和材料， 引物组包括引物1、 引物2、 引物3、 引物 4、 引物5和引物6， 引物组中 各引物干粉1OD； 反应液包括核酸反应液， 核酸反应液包括具有链置换活性的DNA聚合酶、 Buffer、 dNTP、 MgSO4、 Betaine  和荧光染料； 阴性对照组包括不含目的基因反应液； 材料包 括未感染鸭细小病毒的鸭血清样本和鸭坦 步苏病毒 核酸样本； [0009]步骤二： 病毒DNA提取， 使用病毒DNA提取 试剂盒提取样本DNA； [0010]步骤三： 引物稀释， 将试剂盒中引物1和引物2稀释成40uM,引物3和引物4稀释成 5uM,引物5和6稀释成20uM； [0011]步骤四： 扩增反应 体系， 反应浓 缩液15ul， 引物组6ul,模板4ul和总反应 体系25ul；说　明　书 1/5 页 3 CN 114672590 A 3