(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210006504.9 (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 中国医学 科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路151 号 申请人 华润三九医药股份有限公司 　 深圳市中药制造业创新中心有限公 司 (72)发明人 姚辉　王亮　王清　王勇　武立伟　 韩正洲　吴正军　马鹏岗　宋经元　 聂丽萍　 (74)专利代理 机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 1 1250 专利代理师 周卫赛(51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种鉴定茯苓的特异性引物、 试剂盒及鉴别 方法 (57)摘要 本发明提供了一种鉴定茯苓的特异性引物、 试剂盒及鉴别方法， 所述引物如下， 正向引物： 5′ ‑CTCCTCCCAAACGCATTAGC ‑3′； 反向引物： 5 ′ ‑ AATCTGTTTGTCCATCCGACC ‑3′。 本发明基于茯苓的 ITS基因设计了多对引物， 且通过大量引物筛选 研究， 筛选出了最佳的具有种属特异性的引物， 使用上述引物对 可实现目的基因的有效扩增， 从 而使茯苓能够得到快速准确鉴定 。 权利要求书1页 说明书9页 序列表4页 附图2页 CN 114438241 A 2022.05.06 CN 114438241 A 1.一种鉴定茯苓的特异性引物， 其特 征在于， 所述引物如下： 正向引物： 5 ′ ‑CTCCTCCCAAACGCATTAGC‑3′； 反向引物： 5 ′ ‑AATCTGTTTGTCCATCCGACC‑3′。 2.一种鉴定茯苓的试剂盒， 其特 征在于， 含有权利要求1所述的引物。 3.根据权利要求2所述的试剂 盒， 其特征在于， 每支所述试剂 盒包括各自独立包装的引 物液部分和PCR反应液部分； 所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、 dNTPs、 Taq  DNA聚合酶以及无菌超纯 水。 4.一种如权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂 盒在鉴定待测样品中茯苓 成分的应用。 5.一种鉴定茯苓的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取待测样品的总DNA， 备用； (2)以步骤(1)中提取的DNA为模板， 采用如下引物进行PCR扩增： 正向引物： 5 ′ ‑CTCCTCCCAAACGCATTAGC‑3′； 反向引物： 5 ′ ‑AATCTGTTTGTCCATCCGACC‑3′； (3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小， 若所述PCR扩增产物中含有100～200bp 的DNA片段， 则所述待测样品中存在茯苓； 反 之， 则所述待测样品中不存在茯苓。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 提取步骤之前还包括对待测样品进行粉 碎， 然后取粉末与核分裂液混合， 离心， 取沉淀的步骤； 优选的， 待测样品的质量与核分裂液的体积比为(40 ‑150):(800‑1200)； 优选的， 核分裂液含有50 ‑150mM的Tris ‑HCl、 15‑25mM的EDTA、 0.5 ‑0.8M的NaCl和1.5 ‑ 3％PVP‑40(W/V)。 7.根据权利要求5或6所述的方法， 其特 征在于， 在步骤(2)中， PCR反应 体系包括： DNA模板， 2 ～10.5 μL； 正向引物， 2.5 μM， 0.5～1.5 μL； 反向引物， 2.5 μM， 0.5～1.5 μL； 2×Taq PCR MasterMix， 10～15 μL； 无菌超纯 水补至25 μL； 优选的， 所述PCR扩增 程序如下： 94℃预变性5min； 94℃变性30s， 55～59℃退火30s， 72 ℃延伸45s， 进行3 5～40个循环； 然后继续72℃延伸10mi n。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述PCR扩增程序中， 退火温度为57℃。 9.根据权利要求5 ‑8任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中， 所述100～200bp 的DNA片段为172bp或131bp的DNA片段。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述的172bp的DNA片段序列如SEQ  ID  NO.5所示； 所述的131bp的DNA片段序列如SEQ  ID NO.6所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438241 A 2一种鉴定茯苓的特异性引物、 试剂盒及鉴别方 法 技术领域 [0001]本发明属于中药材鉴定技术领域， 具体涉及一种鉴定茯苓的特异性引 物、 试剂盒 及鉴别方法。 背景技术 [0002]茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria  cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。 味甘、 淡， 性平， 具有利水渗湿， 健脾和胃， 宁心安神的功效。 现代研究表明， 茯苓主要含有三萜类和多糖类 两种化合物， 具有利尿、 抗炎和保肝等药理作用。 作为中药八珍之一， 茯苓在食品中的应用 也很广泛。 准确鉴定茯苓不仅保障了临床用药安全， 对规范中药材市场， 推动茯苓产业 发展 也具有重要意 义。 [0003]市面上茯苓的伪品多由淀粉和植物粉末加工而成， 运用理化手段较易区分饮片里 是否有淀粉存在。 而DNA条形码技术依赖样品自身的基因分子信息， 可以用于鉴定样品是否 为茯苓， 但茯苓中多糖含量较高， 特别是对于茯苓饮片和桂枝茯苓丸等含茯苓的常见中药 来说， 蒸制、 晒干等加 工过程会导致样 品的DNA严重降解， 不仅影响PCR扩增效率， 而且扩增 和测序的准确度也较低。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题在于提供一种鉴定茯苓的特异性引物、 试剂盒或者方 法， 采用所述引物、 试剂盒或者方法鉴定茯苓， 鉴定结果准确可靠、 灵敏度高， 能够在短时间 内对大量待测混合物中茯苓进行 快速鉴定， 效率高。 [0005]为此， 本发明提供了一种用于鉴定茯苓的引物， 所述引物如下： [0006]正向引物： 5 ′ ‑CTCCTCCCAAACGCATTAGC‑3′； [0007]反向引物： 5 ′ ‑AATCTGTTTGTCCATCCGACC‑3′。 [0008]本发明提供了一种鉴定茯苓的试剂盒， 含有上述的引物。 [0009]进一步地， 所述的试剂盒， 每支 所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PC R 反应液部分； 所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、 dNTPs、 Taq  DNA聚合 酶以及无菌超纯 水。 [0010]本发明还提供了一种所述的引物或所述的试剂盒在鉴定待测样品中茯苓成分的 应用。 [0011]待测样品可以是新鲜茯苓、 茯苓饮片、 茯苓菌丝或者含有茯苓的中药。 也可以是市 面上茯苓的伪品， 例如淀粉和植物粉末加工成的团块 等。 [0012]其中本发明中， 新鲜茯苓为未经炮制的茯苓， 茯苓菌丝是由新鲜茯苓采用常规培 养方法培养制得， 培养方法可参见文献胡国元等， 《茯苓菌丝体液体培养条件研究》 ， 武汉工 程大学学报， 第32卷第7期。 [0013]含有茯苓的中药 可以是茯苓 配方颗粒、 桂枝茯苓丸等常见中药。 [0014]本发明提供了一种鉴定茯苓的方法， 包括如下步骤：说　明　书 1/9 页 3 CN 114438241 A 3