(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210004939.X (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 中国水产科 学研究院长江水产研究 所 地址 430223 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区武大 科技园武大园一路8号 (72)发明人 王珂　周雪　陈大庆　段辛斌　 刘绍平　 (74)专利代理 机构 北京保识知识产权代理事务 所(普通合伙) 11874 专利代理师 汪浩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/10(2006.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种红鳍 原鲌放流评价方法 (57)摘要 本发明公开了一种红鳍原鲌放流评价方法， 属于动物分子遗传学领域， 采集被放流红鳍原鲌 亲鱼的鳍条， 保存于酒精内； 回捕各放流洄游点 的红鳍原鲌个体， 并取每个个体的鳍条； 提取所 有鳍条样本的DNA； 利用本方法提供的5组双重 PCR引物检测被捕个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的 亲子关系。 本方法利用亲子鉴定技术准确鉴定被 捕个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系， 进而 判断被捕红鳍原鲌个体中放流个体的数量， 实现 对红鳍原鲌放流效果的准确评价。 权利要求书2页 说明书8页 附图1页 CN 114438220 A 2022.05.06 CN 114438220 A 1.一种红鳍原鲌放流评价方法， 其特征在于， 所述全生物降解吹膜材料的原料按重量 份计为： S1、 采集被放 流红鳍原鲌亲鱼的鳍条， 保存于酒精内； S2、 回捕各放 流洄游点的红鳍 原鲌个体， 并取每 个个体的鳍条； S3、 提取所有鳍条样本的红鳍 原鲌DNA； S4、 采用5组双重PCR微卫星引物检测回捕的红鳍原鲌个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲 子关系。 2.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法， 其特征在于： 所述S3 中红鳍原鲌 DNA的提取包括以下步骤： A1、 消化准备： 清洗工具， 取固定于无水乙醇中的样品50～100mg， 用去离子水浸泡 20min， 出去酒精， 重复三次， 新鲜组织样品可省略此步骤； A2、 消化： 剪碎样品， 置于1.5ml离心管中， 加入200μLDNA裂解液， 5μL蛋白酶K(10mg/ mL)， 略离心， 颠倒混匀， 放入5 0℃～55℃水浴锅消化3～5 h， 直至裂解液澄清； A3、 抽提： 按照体积比为25： 24： 1的比例加入酚： 氯仿： 异戊醇200μL， 颠倒晃动15～ 20min， 8000rpm离心5mi n， 吸出上清液， 置 于新的1.5mL离心管中， 重复三次； A4、 沉淀： 加入 ‑20℃预冷的无水乙醇800μL， 若产生絮状沉淀， 则为纯度较高的DNA样 品， 可挑出待用， 12000rpm离心15min， 倒掉上清液， 加入75％的酒精400～800 μL清洗沉淀， 12000rpm离心5mi n， 倒掉上清液， 用滤纸略吸水， 室温放置约2 ～5h晾干； A5、 溶解： 加入ddWater100～200 μL， 涡旋振荡仪震荡10s， 使其溶解， 略离心， 4℃静置1d 以上， 使其充分 混匀； A6、 检测： 1％琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性， 并用NanoDrop2000紫外分光光度 计检 测DNA浓度和纯度； A7、 保存： DNA样品至 于‑20℃保存， 使用时稀释， 终浓度为20～5 0ng/ μL。 3.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法， 其特征在于： 所述S5 中的红鳍原 鲌微卫星标记的5组双重PCR微 卫星引物， 具体引物信息如下：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438220 A 24.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法， 其特征在于： 所述S5 中检测回捕 的红鳍原鲌个体和 被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系包括以下步骤： 将PCR扩增产物在10％ 的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离； 根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型； 所述的PCR反 应体系是2 5ul： 10×PCRBuffer 3ul， 2.5mmol/LdNTP2ul， MgCl23u l， 上下游引物各 1ul， Taq酶 0.5ul， DNA模板2ul， 超纯 水12.5ul。 5.根据权利要求4所述的一种红鳍原鲌放流评价方法， 其特征在于： 所述的PCR反应程 序为： 94℃预变性3min； 94℃变性30s， 退火温度复性30s， 72℃延伸30s， 35个循环； 72℃延伸 10min； 4℃保存。 6.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法， 其特征在于： 所述的红鳍原鲌个 体之间亲缘关系远近的测量方法为根据PCR产物的条带大小， 使用mega5.0软件和 populati on软件做聚类发育树， 根据聚类分析图鉴定个 体之间的亲缘关系。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114438220 A 3