(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210004806.2 (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 合肥艾迪康医学检验实验室有限公 司 地址 230088 安徽省合肥市高新区天柱路5 号信息产业园B座一层、 二层、 三层、 五 层 (72)发明人 蔡嘉慧　王淑一　 (74)专利代理 机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 3 3100 专利代理师 黄素萍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测SMAD4基因全外显子突变的引物、 方法 及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测SMAD4基因全外 显子突变的引物、 方法及试剂盒， 所述特异性引 物包括扩增覆 盖SMAD4基因全部12 个外显子的正 反向引物； 本发明采用Sanger测序法检测SMAD4 基因全外显子突变， 可快速检测SMAD4基因全外 显子的突变。 利用本发明完成的检测结果准确， 可以专一性鉴别SMAD4基因是否突变， 确保了测 定结果的准确性和唯一性； 可辅助疾病诊断， 提 高疾病的风险评估， 对早期干预、 早期治疗有重 要的参考意义。 权利要求书2页 说明书11页 序列表4页 附图3页 CN 114480642 A 2022.05.13 CN 114480642 A 1.一组检测SMAD4基因全外显子序列突变位点的特异性引物， 其特征在于， 包括扩增覆 盖SMAD4基因全部12个外 显子的正、 反向引物， 其碱基序列为： SMAD4‑1F： CAGGTGTGTCGTAG GATTCG SMAD4‑1R： GGGAGAAGGTGGCTAGGTTG SMAD4‑2F： TTTCCTTGCAACGTTAGCTG SMAD4‑2R： GGAGCACAAATTAAATTACCCTG SMAD4‑3F： CTGAGT TGGTAGGATTGTGAGG SMAD4‑3R： TGAAACACTATTGAGATCCTTTTCC SMAD4‑4F： GCGTTTATGCTACT TCTGAATTG SMAD4‑4R： TTAATGTTACTGCCTGCCGC SMAD4‑5F： CCGCTGAATAAATGACTTTTGC SMAD4‑5R： TTCCAAGTGATTGTGCATAC C SMAD4‑6‑7F： CCCATCTTTATAGTTGTGCATTATC SMAD4‑6‑7R： AAAACAGAAAACAAAGCCCTACC SMAD4‑8F： TTGGCAGATAGCACTGA AATG SMAD4‑8R： CCCCATAATTCCATTAAAGCC SMAD4‑9F： TGTGGAGTGCAAGTGAAAGC SMAD4‑9R： TGTACATG GGAAAACATAACCTTG SMAD4‑10F： GAATTCATACTACATGCTC CTGACAC SMAD4‑10R： TTTTCCATTCCTTCCACCC SMAD4‑11F： TCCAAGCCACCTTTCCTAAC SMAD4‑11R： ACAGAAGAACAGATTTTACCAATTC SMAD4‑12F： AGGATGGGAAGAGATCAC CC SMAD4‑12R： CAGGATTGTATTTTGTAGTCCACC。 2.如权利要求1所述的特异性引物， 其特 征在于， 还 包括一对测序引物， 其碱基序列为： M13F： TGTA AAACGACGGCCAGT； M13R： AACAGCTATGAC CATG。 3.如权利要求1所述的特异性引物， 其特征在于， SMAD4 ‑1F： SMAD4 ‑1R、 SMAD4 ‑2F： SMAD4‑2R、 SMAD4 ‑3F： SMAD4 ‑3R、 SMAD4 ‑4F： SMAD4 ‑4R、 SMAD4 ‑5F： SMAD4 ‑5R、 SMAD4 ‑6‑7F： SMAD4‑6‑7R、 SMAD4 ‑8F： SMAD4 ‑8R、 SMAD4 ‑9F： SMAD4 ‑9R、 SMAD4 ‑10F： SMAD4 ‑10R、 SMAD4 ‑11F： SMAD4‑11R或SMAD4 ‑12F： SMAD4 ‑12R的比值均为1： 1。 4.如权利要求2所述的特异性引物， 其特 征在于， M13F： M13R的比值 为1： 1。 5.一种检测SMAD4基因全外 显子序列突变位 点的方法， 其包括以下步骤： (1)提取样本中的基因 组DNA； (2)利用SMAD4基因每个外显子对应 的正、 反向扩增引 物对前述(1)中的DNA进行扩增， 获得覆盖SMAD4全外 显子序列突变位 点的扩增产物； (3)利用一对测序引物M13F和M13R对(2)中的扩增产物进行正、 反向测序， 获得所述扩 增产物的基因序列； (4)将(3)中的基因序列与SMAD4基因野生型参考序列(NG_013013.2)进行比较， 确定突权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480642 A 2变位点是否存在。 6.一种检测SMAD4基因全外显子序列突变位点的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包 括： 样本DNA提取试剂， 无水乙醇， 检测体系PCR反应液、 测序体系反应液， 阴性对照品。 所述 检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物， 所述测序体系反应液包括一对测序引物 M13F和M13R， 所述至少一对扩增引物 选自SMAD4 ‑1F/SMAD4 ‑1R、 SMAD4 ‑2F/SMAD4 ‑2R、 SMAD4 ‑ 3F/SMAD4 ‑3R、 SMAD4 ‑4F/SMAD4 ‑4R、 SMAD4 ‑5F/SMAD4 ‑5R、 SMAD4 ‑6‑7F/SMAD4 ‑6‑7R、 SMAD4 ‑ 8F/SMAD4 ‑8R、 SMAD4 ‑9F/SMAD4 ‑9R、 SMAD4 ‑10F/SMAD4 ‑10R、 SMAD4 ‑11F/SMAD4 ‑11R或SMAD4 ‑ 12F/SMAD4 ‑12R， 其碱基序列为： SMAD4‑1F： CAGGTGTGTCGTAG GATTCG SMAD4‑1R： GGGAGAAGGTGGCTAGGTTG SMAD4‑2F： TTTCCTTGCAACGTTAGCTG SMAD4‑2R： GGAGCACAAATTAAATTACCCTG SMAD4‑3F： CTGAGT TGGTAGGATTGTGAGG SMAD4‑3R： TGAAACACTATTGAGATCCTTTTCC SMAD4‑4F： GCGTTTATGCTACT TCTGAATTG SMAD4‑4R： TTAATGTTACTGCCTGCCGC SMAD4‑5F： CCGCTGAATAAATGACTTTTGC SMAD4‑5R： TTCCAAGTGATTGTGCATAC C SMAD4‑6‑7F： CCCATCTTTATAGTTGTGCATTATC SMAD4‑6‑7R： AAAACAGAAAACAAAGCCCTACC SMAD4‑8F： TTGGCAGATAGCACTGA AATG SMAD4‑8R： CCCCATAATTCCATTAAAGCC SMAD4‑9F： TGTGGAGTGCAAGTGAAAGC SMAD4‑9R： TGTACATG GGAAAACATAACCTTG SMAD4‑10F： GAATTCATACTACATGCTC CTGACAC SMAD4‑10R： TTTTCCATTCCTTCCACCC SMAD4‑11F： TCCAAGCCACCTTTCCTAAC SMAD4‑11R： ACAGAAGAACAGATTTTACCAATTC SMAD4‑12F： AGGATGGGAAGAGATCAC CC SMAD4‑12R： CAGGATTGTATTTTGTAGTCCACC M13F： TGTA AAACGACGGCCAGT； M13R： AACAGCTATGAC CATG。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 所述检测体系PCR扩增反应液还包括2 ×PCR Buffer、 dNTPs和KOD  FX DNA Polymerase。 8.如权利要求6所述的试剂盒， 所述测序体系反应液还包括测序纯化液、 EDTA、 无水乙 醇、 75％乙醇、 HIDI和Bigdye  Terminator V3.1。 9.如权利要求8所述的试剂盒， 所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸 酶。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480642 A 3